一、大鼠原位肝移植研究进展（论文文献综述）
洪丽萍[1]（2021）在《转录因子YY1在大鼠肝移植急性排斥反应中的作用研究》文中提出研究背景及目的:肝移植是终末期良性肝病的首选治疗方法,免疫排斥反应是制约肝移植术后供肝存活的瓶颈。辅助性T细胞17（Helper T 17 cells,Th17）和调节性T细胞（Regulatory T cells,Treg）在免疫排斥反应中起到关键作用,前者促进免疫排斥,而后者维持免疫耐受。阴阳1（Yin-yang 1,YY1）作为核转录因子,在许多生物学过程中发挥作用。研究发现,YY1可以通过启动白介素-6（Interleukin-6,IL-6）的转录表达而促进Th17的分化,同时可以阻断叉头状转录因子p3（Forkhead box protein p3,Foxp3）的表达和活性来抑制Treg的分化和功能,从而导致Th17/Treg细胞失衡。而YY1介导的Th17/Treg细胞失衡对肝移植免疫排斥反应的作用,尚不可知。因此,本实验拟通过观察YY1在大鼠原位肝移植急性排斥模型供肝中的表达改变,过表达YY1质粒和诱导培养Lewis大鼠骨髓来源树突状细胞（Dendritic cells,DCs）及磁珠分选BN大鼠脾脏来源的CD4+T淋巴细胞,进而探讨YY1在肝移植免疫排斥中的作用,为临床诊治提供相关思路及理论依据。研究方法:1)构建大鼠原位肝移植模型:采用的是改良式Kamada’s“二袖套法”,假手术组（Sham组）:未做肝移植手术的Brown Norway大鼠（BN大鼠）,同基因移植组（Syngraft组）:供体为BN大鼠,受体亦为BN大鼠,异基因移植组（Allograft组）:供体为Lewis大鼠,受体为BN大鼠。收集术后5 d及10 d的供肝组织和血清,对供肝组织进行形态学观察,利用免疫组织化学染色（Immunohistochemical staining,IHC）检测CD3的表达,血清进行肝功能检测（AST、ALT）,酶联免疫吸附测定（ELISA）检测IL-6及肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）的水平。2)将术后10 d的供肝组织（异基因移植组5例、同基因移植组3例）进行蛋白质组学分析,以蛋白质定量跑胶、预质谱数据库比对、标记效率为质量控制点进行样品的质控,以组间蛋白表达差异倍数大于1.2且P<0.05来筛选差异表达蛋白。3)根据筛选出的组间蛋白表达差异结果,选取转录因子YY1作为本实验的研究对象,利用IHC和蛋白质免疫印迹（Western blot,WB）检测假手术组、同基因移植组及异基因移植组术后5 d和10 d移植肝组织中YY1的表达,通过定量聚合酶链反应（Quantitative polymerase chain reaction,qPCR）检测mRNA表达水平,利用IHC检测CD86的表达。4)构建YY1过表达质粒,利用293T细胞进行慢病毒的包装,然后进行病毒的浓缩和滴度测定。5)体外培养Lewis大鼠骨髓来源的DCs及磁珠分选BN大鼠脾脏来源的CD4+T淋巴细胞。将YY1过表达慢病毒感染im DCs（Immature dendritic cells,im DCs）后利用倒置显微镜观察细胞形态,利用流式细胞术对其进行表型鉴定,通过流式细胞术检测Th1细胞和Th17细胞相关胞内细胞因子的含量。研究结果:1)成功构建了大鼠原位肝移植模型,术后5 d和10 d异基因移植组表现为急性排斥反应改变,汇管区CD3+T淋巴细胞明显浸润,血清中AST、ALT、IL-6、TNF-α的表达较同基因移植组高（P<0.05）。2)蛋白质组学分析结果显示:蛋白质质量好、总量足够且样本间平行性较好,蛋白预质谱显示酶解正常,色谱质谱行为正常,可用于后续差异分析。以组间蛋白表达差异倍数大于1.2且P<0.05为标准来筛选差异蛋白,共计3276个,与同基因移植组相比,异基因移植组中差异表达蛋白有2175个上调,1101个下调。YY1蛋白在异基因移植组中是上调的,组间差异表达倍数为1.255且P=0.00307。3)大鼠原位肝移植术后10 d异基因移植组肝组织中YY1 mRNA的表达水平高于同基因移植组及假手术组（P<0.05）,异基因移植组术后5 d YY1的蛋白表达量高于同基因移植组及假手术组（P<0.05）,术后5 d及10 d异基因移植组中YY1和CD86的IHC阳性表达均高于同基因移植组及假手术组。4)构建的YY1过表达质粒经测序后显示基因序列完全正确,慢病毒包装后进行滴度测定,结果为:5×108TU/m L、1×109TU/m L。5)分离培养Lewis大鼠骨髓来源的DCs,YY1过表达慢病毒感染im DCs的感染效率为80%左右,摸索得最适MOI值为15。流式细胞术显示:m DCs表面分子CD80、CD86及MHCⅡ的表达均高于im DCs,YY1过表达质粒组的DCs表面分子CD80、CD86和MHCⅡ的表达均高于空载体组及PBS组,使用流式细胞术检测Th1和Th17细胞相关胞内细胞因子含量,发现感染YY1过表达慢病毒的DCs可促进BN大鼠脾脏来源的CD4+T细胞向Th17方向分化,YY1过表达质粒组的IL-17和IFN-γ的分泌较空载体组及PBS组增多（P<0.05）。结论:1)Lewis大鼠作为供体及BN大鼠作为受体可成功构建大鼠原位肝移植模型。2)YY1在大鼠肝移植供肝中的表达水平显着升高。3)YY1可能通过促进Th17细胞的分化,从而引起急性排斥反应。
朱宏伟[2]（2021）在《SD大鼠自体原位肝移植缺血再灌注损伤后粪便菌群的变化规律》文中提出[目 的]构建SD大鼠自体原位肝移植缺血再灌注损伤的动物模型,探索肝移植缺血再灌注损伤后不同时间节点大鼠粪便菌群的变化规律,分析肝移植缺血再灌注损伤引起粪便菌群改变的可能机制,进而为将来从肠道菌群的角度对肝移植缺血再灌注损伤进行干预与治疗时提供指导。[方法]采用自体原位肝移植的方法构建大鼠肝脏的缺血再灌注损伤动物模型,其中模型组（M组）根据术后取材时间节点不同又分为M1、M4、M7、M10、M14、M21、M28七个组,并建立假手术组（S组）进行对照。术前分别对以上8组（n=5）大鼠进行血液、粪便标本的搜集。假手术组（S组）在术后第1天进行肝脏、肠管、血液及粪便标本的采集,模型组（M组）分别对应于术后第1d、4d、7d、10d、14d、21d、28d进行肝脏、肠管、血液及粪便标本的采集。大鼠血液进行ALT、AST、TBIL、WBC、NEUT、LYM指标的检测,从血液学角度对肝脏损伤、胆汁淤积及全身炎症情况进行评估与分级。制作并观察肝脏、回盲部肠管病理切片,从病理学角度了解肝脏组织、肠管黏膜的损伤情况。采用高通量基因测序对大鼠新鲜粪便进行检测,了解AOLT缺血再灌注损伤后粪便菌群谱的变化规律。[结 果]1、本次研究采用自体原位肝移植的方法构建肝移植缺血再灌注损伤的动物模型,建模成功率100%。在肝移植缺血再灌注损伤术后第1天,ALT、AST、TBIL指标均较假手术组明显升高,差异皆具有明显统计学意义（P<0.05）。肝脏组织病理图片显示,M1组肝脏组织呈现出较重损伤,Suzuki’ s评分3分,以上结果均证实AOLT动物模型能反映出肝脏的IRI情况,是研究肝移植IRI的理想动物模型。2、AST、ALT、TBIL与肝脏组织病理在AOLT缺血再灌注损伤术后的变化规律基本保持一致。其中,模型组M1中的AST、ALT、TBIL在术后第1天分别为 776.20±298.79、241.00±66.21 和 2.90±2.00,它们显着高于假手术组（S）及其余各模型组,与各组间比较均存在明显差异（P<0.05）,其余各模型组与假手术组（S）之间未见明显差异。由各组AST、ALT、TBIL的变化趋势图和肝脏组织的病理图片可以看出SD大鼠在经历AOLT缺血再灌注后,术后早期（第1天）肝组织损伤、胆汁淤积最为明显,进行到术后中期时肝脏的损伤明显减轻,至术后晚期（第28天）已经完全恢复至术前正常水平。3、通过对大鼠血液WBC、NEUT、LYM指标进行检测以及回盲部肠管组织病理切片的观察,我们发现AOLT缺血再灌注损伤也可导致肠管组织的损伤与炎症反应的产生,且两者的变化平行发生。各模型组中WBC、NEUT、LYMD的值均显着高于假手术组（S）,且与假手术组（S）比较的P值均小于0.05。其中由各指标的变化趋势和回盲部肠管组织病理图片可以看出炎症反应及肠道黏膜损伤在肝移植术后早期即可发生,但程度较轻;在移植术后中期（第4-14天）呈现出先增加后逐渐递减的趋势,以第7-14d炎性反应及肠道黏膜损伤表现得尤其显着;至术后晚期（第28天）观察结束时炎性指标仍略高于术前正常水平,肠道黏膜呈现轻度损伤,但均较术后中期明显好转。4、SD大鼠正常情况下粪便内菌群在门的水平上以拟杆菌门和厚壁菌门为主,且它们的比值约为1。在属的水平层面,正常大鼠粪便菌群丰度占比排名前五（丰度均>1%）的菌群依次为:乳杆菌属（Lactobacillus）、普氏菌属（Prevotella）、颤螺菌属（Oscillospira）、疣微菌科瘤胃球菌属（RuminococcaceaeRuminococcus）、拟杆菌属（Bacteroides）。在经历肝移植IRI后,大鼠粪便内菌群呈现出明显规律性的变化。在门的水平上,厚壁菌门在术后早期（第1天）明显增加,而术后中期（第4天）开始逐渐减少,至术后晚期时（第28天）又开始出现出现增加趋势,而拟杆菌门在此时则完全表现出与厚壁菌门截然相反的变化趋势。在属的层面上,肝移植缺血再灌注术后早期（第1天）乳杆菌属、疣微菌科瘤胃球菌属、拟杆菌属、Blautia的丰度在总菌群中的比例显着增加,普氏菌属、颤螺菌属则明显减低。粪便菌群Alpha多样性分析显示此时菌群的多样性降低。术后中期（第4天）乳杆菌属、疣微菌科瘤胃球菌属开始逐渐降低,普氏菌属、颤螺菌属开始增加,拟杆菌属和Blautia在此期间则先后呈现先增后减的变化趋势,菌群的多样性也开始逐渐增加。至术后晚期（第28天）观察结束时疣微菌科瘤胃球菌属、颤螺菌属、拟杆菌属及Blautia基本恢复至术前水平,普氏菌属在总菌群中的比重仍高于乳杆菌属,但它们之间的差距在进一步缩小,呈现出向术前趋于一致的变化趋势,菌群的多样性仍高于术前水平。[结论]1、SD大鼠自体原位肝移植IRI模型是研究肝移植IRI的理想模型。2、自体原位肝移植IRI可引起粪便内菌群发生变化,且该变化具有明显的规律性。3、大鼠肝脏的IRI在AOLT术后早期表现得最为严重,但恢复也较为迅速。术后中、后期主要表现为AOLT缺血再灌注损伤继发的炎症及肠道管损伤,AOLT缺血再灌注损伤后大鼠粪便菌群的变化与肠道损伤及全身炎症具有一定的相关性。
严启航[3]（2021）在《HO-1通过抑制p38 MAPK激活减轻大鼠DCD肝移植缺血再灌注损伤》文中进行了进一步梳理[目的]缺血再灌注损伤（Ischemia Reperfusion Injury,IRI）常发生在肝移植、肝切除、休克等情况下,特别对于肝移植来说,手术过程中不得不先阻断血流,完成血管重建后再恢复肝脏供血,从而导致了 IRI。由于肝移植IRI是不可避免且可以预见的,对于如何减轻IRI以提高供肝质量是目前改善肝移植术后患者预后和生活质量的首要策略。本课题组前期的研究已经发现血红素氧合酶-1（Heme Oxygenase-1,HO-1）在肝脏缺血再灌注损伤（Hepatic Ischemia Reperfusion Injury,HIRI）中发挥着重要的抗炎、抗氧化、抗应激功能。本研究拟通过腺相关病毒（Adeno Associated Virus,AAV）作为载体,构建大鼠HO-1的过表达载体,以及通过RNA干扰技术靶向干扰HO-1 mRNA的shRNA AAV载体,转入大鼠体内从而诱导肝脏HO-1过表达或将其沉默,再通过构建大鼠肝移植缺血再灌注损伤模型,在诱导供肝HO-1差异性表达的前提下,观察在肝移植缺血再灌注损伤后移植肝局部炎症以及组织病理学的改变,并初步探究其内在分子机制,以为临床上改善肝移植IRI提供一种新的思路和方法。[方法]1 构建大鼠HO-1 AAV载体、HO-1 shRNA AAV载体,分别转入SD大鼠体内,21 d后获取肝脏,荧光显微镜下观察共表达绿色荧光蛋白,qRT-PCR检测肝组织HO-1表达情况,验证转染效果。2 以热缺血10 min、冷缺血4 hr为基础构建SD-SD大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤模型,采用“二袖套法”吻合门静脉和肝下下腔静脉,采用“支架法”重建胆总管。再灌注后6hr、24hr、3d和7d分别观察肝功能、肝脏组织形态学以及HO-1和炎症因子随时间的变化,明确变化最明显的时间点,进行后续研究。3 通过尾静脉给供体SD大鼠注射AAV载体,诱导供肝HO-1高表达和低表达,并在注射后第21 d构建SD-SD大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤模型,获取血清检测肝酶ALT和AST变化,获取肝脏组织行HE染色观察组织病理学变化,检测肝组织HO-1、CHOP以及炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达情况,检测肝组织HO-1、p-p38 MAPK、p38 MAPK、CHOP以及炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表达情况。[结 果]1 构建HO-1 AAV过表达载体和HO-1 shRNAAAV载体,经测序证明扩增序列正确,表明载体成功构建。2 AAV载体通过尾静脉注射方式能诱导SD大鼠肝脏HO-1转录活性升高和降低,与相应空载AAV病毒组相比有统计学差异（P<0.05）。3 成功构建SD-SD大鼠肝移植缺血再灌注损伤模型。4 肝移植缺血再灌注后ALT、AST活性迅速升高,并在6-24hr达到峰值,7 d左右降至基本正常;肝组织病理学损伤6 hr已经显现,并在24 hr的时候损伤最重,7 d仍可见坏死灶存在。说明肝移植IRI损伤在再灌注后迅速发生,且病理学改变滞后于分子标志物变化。5 通过术前用AAV对供肝HO-1进行诱导处理,在建立肝移植模型6hr后仍能保持高效诱导HO-1高表达或抑制其表达。HO-1的转录活性和蛋白在过表达组的和shRNA干扰组均比相应空载AAV组升高或降低,其差异有统计学意义（P<0.05）。6 在肝移植IRI后6 hr,sh-HO-1组ALT、AST较AAV空载病毒组明显升高（P<0.05）,AAV-HO-1组ALT、AST较AAV空载病毒组明显降低（P<0.05）。行肝组织切片HE染色,光镜下观察sh-HO-1组的坏死区域更大,炎性细胞浸润更明显（P<0.05）。检测肝脏局部炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6转录活性和蛋白表达,sh-HO-1组的升高和AAV-HO-1组的降低与其对应空载AAV组相比有统计学意义（P<0.05）。同时HO-1的升高伴随着p38 MAPK磷酸化的降低以及CHOP表达的下降,提示HO-1可能是通过减少p38MAPK介导的炎症信号通路的激活以及减少CHOP介导的内质网应激来实现。[结 论]1 成功构建HO-1过表达和HO-1 shRNA AAV载体,能转染并在大鼠肝脏诱导或抑制HO-1表达。2 成功建立SD-SD大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤模型。3 术前诱导供肝HO-1高表达能减轻肝移植缺血再灌注损伤,而抑制供肝HO-1则会加重损伤。4 HO-1可能通过抑制p38 MAPK介导的炎症信号通路的激活以及减少CHOP介导的内质网应激从而减轻缺血再灌注损伤。
吴皓[4]（2020）在《抑制Kupffer细胞中SCIMP蛋白活性诱导大鼠肝移植免疫耐受的机制研究》文中指出目的:棕榈酰化跨膜衔接蛋白SCIMP是一种SLP衔接子和C末端Src激酶相互作用的膜蛋白,特异性表达于B细胞以及APC中,在免疫反应中发挥重要作用。本文旨在探讨干扰Kupffer细胞（KCs）SCIMP对诱导大鼠原位肝移植术免疫耐受微环境的形成以及相关机制的研究。方法:1.建立大鼠原位肝移植急性排斥反应模型,WB、免疫组化以及免疫荧光检测肝移植术后SCIMP的表达定位。向模型大鼠门静脉注入抗SCIMP mAb（0.35mg/只）,对照组注入同等的Control mAb,测定血清肝功以及肝组织病理变化。接着,将模型大鼠随机分为:SCIMP-siRNA大组:SHAM组,大鼠开腹手术暴露门静脉,并经门静脉注入甘露糖共轭聚合物包裹的SCIMP-siRNA（2mg/kg,3天/次,连续2周）;LT组,大鼠原位肝移植手术,并经门静脉注入甘露糖共轭聚合物包裹的SCIMP-siRNA（2mg/kg,3天/次,连续2周）;Control大组:SHAM组,大鼠开腹手术暴露门静脉,并经门静脉注入同等剂量甘露糖共轭聚合物包裹的Control-siRNA;LT组,大鼠原位肝移植手术,并经门静脉注入同等剂量甘露糖共轭聚合物包裹的Control-siRNA。术后WB检测各组肝移植术后SCIMP的表达;HE检测大鼠肝组织病理变化,并进行排斥反应活动评分;提取KCs,FCM检测大鼠CD80（+）MHCII（+）KCs数量的变化。2.分离野生型大鼠移植术后的KCs,免疫疫光以及免疫共沉淀检测SCIMP与MHC II的关系。提取上述各组KCs与初始T细胞进行共培养,CFSE以及EdU检测KCs对T细胞增殖分化的影响。接着提取野生大鼠KCs,将细胞实验分为两组:Scramble组,KCs转染错意序列,慢病毒对照组;SCIMP-shRNA组,KCs转染shRNA-SCIMP慢病毒组。100ng/mL LPS在1h、6h、12h、24h、36h、48h处理上述各组。WB检测TLR4、MyD88、p-TAK1、p-MMK、p-p38、p-JNK、p-p65、JAK3、JAK1、p-STAT6、PPARγ、Bid、Bax、Cleaved-Caspase3、Bcl2蛋白水平的变化;ELISA检测炎症因子IL-6、IL-10、IL-12以及氧化产物H2O2的变化;RT-PCR检测细胞内M2标志物Arg1、Retnla以及吞噬凋亡Tim-4、Mfge8、Mertk、CD36、Gas6、Scarf mRNAs水平的变化;FCM检测大鼠CD204（+）CD206（+）KCs数量的变化;TUNEL检测KCs的凋亡;噬菌实验检测各组KCs对凋亡T细胞的吞噬能力;予以JAK3阻断剂（PF-06651600）/STAT6阻断剂（As1517499）后,WB检测JAK3、p-STAT6、PPARγ、CD206、Tim-4、Mfge8、Gas6蛋白水平表达。3.动物实验中,按照方法1中的分组建立大鼠模型,术后TUNEL检测肝组织的凋亡情况;检测大鼠外周血清ALT、AST水平的变化;免疫组化检测肝组织HGF表达水平;余下各组大鼠作为观察生存期之用,观察期以大鼠死亡为终点,并做Log-Rank生存资料分析。结果:1.在动物实验中,随着时间推移SCIMP表达逐渐升高,且在术后9d达到高峰,且SCIMP特异性的表达于KCs。阻断SCIMP功能后,SCIMP mAb组大鼠血清肝功能逐渐恢复正常水平,且肝组织病理改变接近正常肝脏,然而Control mAb组大鼠表现出了急性排斥反应。与LT对照组比较,干扰KCs SCIMP后,促炎因子IL-6、IL-12在SCIMP-siRNA组表达接近正常水平,抑炎因子IL-10水平明显升高,且肝组织病理变化接近正常,SCIMP-siRNA组大鼠均为非确定性排斥反应,差异具有明显的统计学意义（P<0.05）。MHC II（+）CD80（+）双阳性KCs数量在干扰KCs SCIMP后明显减少。2.在细胞实验中,免疫荧光示MHC II和SCIMP均表达于KCs细胞膜。免疫共沉淀进一步证实,SCIMP与MHC II有相互作用;干扰KCs SCIMP能够明显抑制T细胞的增殖;干扰SCIMP抑制了TLR4/NFκB/MAPK蛋白的表达,促炎因子IL-6、IL-12减少,抗炎因子IL-10增多,与对照组比较差异具有明显统计学意义（P<0.05）;干扰KCs SCIMP后JAK3、p-STAT6、PPARγ表达增高,而JAK1的表达未见明显变化,并且随着时间推移活化的KCs向M2型极化的数量逐渐增多,KCs对凋亡T细胞的吞噬清除能力增强,凋亡清除相关桥接分子Tim-4、Mfge8、Gas6的转录与表达增高,与对照组比较差异具有明显统计学意义（P<0.05）;予以JAK以及STAT6阻断剂验证了抑制KCs SCIMP可通过JAK3/STAT6/PPARγ通路增强KCs清除凋亡细胞的能力。3.在动物实验中发现肝移植术后肝细胞凋亡明显增加,然而SCIMP-siRNA组肝脏凋亡细胞与对照组比无明显差异,并且肝功能恢复到基本正常的水平。同时,SCIMP-siRNA组肝细胞生长因子（HGF）水平升高,SCIMP-siRNA组大鼠生存时间明显延长,且基本都超过了100d,与LT对照组比较差异具有明显统计学意义（P<0.05）。结论:肝移植术后KCs SCIMP表达增加,并且SCIMP与MHCII功能呈正相关;干扰KCs SCIMP通过抑制TLR4/NFκB/MAPK以及激活JAK3/STAT6/PPARγ促进KCs向免疫耐受的M2型极化,减少炎症因子释放,促进KCs清除凋亡T细胞的能力,改善肝组织病理改变,并且延长了大鼠肝移植术后的生存时间,有利于免疫耐受微环境的形成。
李婷[5]（2020）在《肝脏异种移植后CD47-SIRPα不兼容介导血细胞吞噬作用的研究》文中进行了进一步梳理背景:临床肝移植的成功开展,为肝脏疾病的外科治疗开启了新的篇章。目前肝移植已经成为公认的治疗终末期肝病的唯一有效手段,同时也是急性爆发性肝衰竭、肝细胞癌、肝门部胆管癌和一些代谢性疾病的最佳选择。随着手术技术和免疫抑制剂的不断进步,肝移植的手术适应证不断扩大,可能的受益人群也在不断的增加,伴随而来的便是日益凸显的供体短缺问题。虽然活体肝移植、心脏死亡后器官捐献和其他一些边缘供肝的应用可以一定程度上缓解供体短缺带来的压力,然而由于数量有限并且会增加潜在的并发症无法从根本上解决问题。从长远的角度来讲,最实用和有效的解决方法便是异种移植。猪由于其器官大小及生理特点与人类类似并且具有良好的繁殖特性,基因修饰的可行性等优势成为了理想的异种供器官来源。然而相比于非灵长类哺乳动物而言,显然猪与人的亲缘性更远,因此需要更大程度的基因修饰。识别可能获益的遗传表位靶点并辨别其可能的作用对于转基因猪遗传修饰表位的筛选显得至关重要。随着各种转基因猪的不断问世,猪器官异种移植取得了重大进展,异位猪心脏异种移植和肾异种移植分别达到了 945天和435天的生存记录。然而,异种的猪肝脏移植存活时间却仍然无法突破一个月。原因虽然尚不十分明确,但是与凝血功能失调特别是严重的血小板丢失导致的致命出血密切相关。此外,贫血的发生被认为也与肝脏异种移植相关。目前认为异种肝移植后血小板减少的主要原因包含以下两点:（1）猪内皮细胞与灵长类动物的血小板之间的细胞表面受体-配体相互作用不协调;（2）猪肝内皮抗原天然抗体的存在,导致内皮细胞活化。其中,脱唾液酸蛋白受体-1（asialoglycoprotein receptor-1,ASGR1）和 CD11b/CD18（MAC-1）的作用较为明确。同样,猪肝脏的吞噬细胞可以参与人红细胞的吞噬作用。学界普遍认为CD47-信号调节蛋白α（signal regulatory protein-α,SIRPα）信号通路通过识别自我与非我调节吞噬反应,在体外的吞噬实验和体内的细胞移植实验中可介导排斥反应,可能参与了异种肝移植后的血小板减少和贫血的发生,但一直缺乏有力的器官水平的证据。研究目的:通过小鼠肝移植模型及大鼠-小鼠异种肝移植模型,探索CD47-SIRPα不兼容在肝脏移植器官水平对血细胞吞噬作用的影响,从而为转基因猪遗传修饰的表位筛选提供可靠的依据。实验方法:（1）通过完善技术细节和优化非技术细节构建出成熟稳定可靠的小鼠肝移植模型。（2）利用小鼠肝移植模型,探究在同种同基因肝移植后,CD47-SIRPα不兼容对外周血红细胞和血小板计数的影响。并通过免疫荧光染色观察CD41荧光信号的变化以及与F4/80的共定位现象。（3）构建大鼠-小鼠异种肝脏移植模型,通过组织学检查、ALT检测及流式细胞技术,确定其存在排斥反应及产生的排斥反应类型。（4）使用大鼠-小鼠肝脏异种移植模型,探究在异种肝移植后,排斥反应环境下,CD47-SIRPα不兼容对外周血红细胞和血小板计数的影响。并通过流式细胞技术检测血小板活化的情况。结果:（1）通过优化选择小鼠品系及胆道支架,小鼠原位肝移植的远期预后可以达到2周、1个月及3个月100%、80%及80%的生存率。（2）同种同基因肝移植模型后,野生型（wild-type,WT）肝脏移植后,与WT受体小鼠相比,CD47KO小鼠的红细胞计数无明显下降,血小板计数术后第1天（Postoperative day 1,POD1）和POD5有轻度下降。免疫荧光染色共聚焦显微镜观察,CD41荧光信号无明显增加,且与F4/80无共定位现象。（3）选用未脱乳与受体小鼠体重相仿的F344大鼠构建大鼠-小鼠异种肝移植模型,组织学检查和ALT检测证实存在严重的排斥反应。流式检测证实主要的浸润细胞为CD8+T细胞,且T细胞的免疫表型从幼稚的和中枢记忆T细胞向效应型记忆T细胞大量转化。（4）利用大鼠-小鼠异种肝移植模型,F344肝脏移植后,与WT受体小鼠相比,CD47KO小鼠外周血红细胞和血小板的变化并没有显着差异。两组的红细胞、血小板计数均随着时间的推移而不断下降,并且活化的血小板比例无明显变化。结论:（1）小鼠品系和胆道支架的选择制约至小鼠原位肝移植的远期预后。（2）同基因小鼠肝脏移植后,CD47-SIRPα不兼容不能介导肝脏对血细胞的吞噬作用。（3）大鼠-小鼠异种肝移植后产生的排斥反应主要是由CD8+T细胞介导的排斥反应。（4）大鼠-小鼠异种肝移植后,CD47-SIRPα不兼容亦不能介导肝脏对血细胞的吞噬作用。
侯宾[6]（2020）在《HO-1基因修饰的BMMSCs联合常温机械灌注保存DCD供肝对大鼠移植肝中胆管上皮细胞的保护作用》文中研究指明目的:研究血红素加氧酶-1（HO-1）修饰的骨髓间充质干细胞（BMMSCs）联合常温机械灌注（NMP）对大鼠心脏死亡后捐献（DCD）供肝移植后胆管上皮细胞（BEC）及其功能的保护作用。方法:1.采用SPF级的2～3周龄40～60 g健康的雄性SD大鼠,经脊髓离断除死,无菌条件下剥离出股骨和胫骨,采用全骨髓贴壁筛选法在37℃、5%CO2的孵育箱中培养到第三代,并通过对BMMSCs的分化能力、生长形态及表面特异性标记物进行流式表型鉴定。2.将载有HO-1基因的腺病毒转染第三代BMMSCs,构建HO-1转染的骨髓间充质干细胞模型（Ad-HO-1/BMMSCs）。3.建立体外稳定的NMP系统装置。4.采用6～8周龄体重200～220 g雄性SD受体大鼠构建心脏死亡后热缺血30 min DCD肝移植模型并按照随机数表法随机分成假手术组（S组）、冷保存组（SCS组）、单纯NMP组（NMP组）、BMMSCs联合NMP组（BP组）和Ad/HO-1修饰的BMMSCs联合NMP组（HBP组）,其中NMP组、BP组和HBP组均进行4 h体外灌注。各组分别于移植术后0、1、7和14 d取材并检测相关指标。5.观察各组大鼠的生存状态及生存时间,采用生化方法检测各组大鼠肝功能,通过苏木素-伊红染色分析各组大鼠胆管病理学改变,通过蛋白质免疫印迹法以及免疫组化染色检测BEC中细胞角蛋白19（CK19）表达,通过细胞凋亡（TUNEL）染色测定凋亡的BEC,免疫组化法检测凋亡相关蛋白caspase-3的表达。结果:1.经BMMSCs以及Ad-HO-1转染的BMMSCs（Ad-HO-1/BMMSCs）的形态、细胞分化功能和表性鉴定,证实本实验中采用的干细胞为符合标准的BMMSCs和Ad-HO-1/BMMSCs。2.体外成功建立了稳定运行的NMP系统装置。3.体外成功构建雄性SD大鼠在心脏死亡后热缺血30 min大鼠DCD原位肝移植模型。4.HBP组和BP组大鼠术后0、1、7和14 d存活率均较SCS组明显升高,以HBP组升高更为显着,术后1 d存活率达100%。14 d存活率仍明显高于SCS组、NMP组和BP组[90%（18/20）比20%（4/20）、40%（8/20）、45%（9/20）,均P<0.05]。通过对肝移植术后7-14 d各组SD受体大鼠移植肝进行病理学检测,结果表明Ad-HO-1/BMMSCs联合NMP保护DCD供肝的方法能够更加明显的减轻胆管上皮细胞的炎症损伤。随后我们的研究发现HBP和BP组BEC中CK19蛋白表达明显高于SCS和NMP组,而7 d至14 d HBP组CK19蛋白表达高于BP组,各时间点HBP组CK19蛋白表达与S组相比无明显改变。通过对凋亡的BEC进行检测,结果发现SCS组和NMP组移植肝的BEC中的凋亡细胞数较HBP和BP组明显增加,而7 d至14 d BP组的凋亡数较HBP组进一步增加。表明Ad-HO-1/BMMSCs联合NMP对BEC的保护作用明显优于SCS组、NMP组和BP组。结论:1.从雄性SD大鼠骨髓中提取并培养的BMMSCs为符合本实验所需要且符合标准的BMMSCs;将HO-1基因转入BMMSCs构建Ad-HO-1/BMMSCs的方法是可行的,为后续实验提供细胞学基础。2.通过成功构建稳定的体外NMP系统以及大鼠原位肝移植模型,为接下来的实验提供动物模型基础。3.采用Ad-HO-1/BMMSCs联合NMP保护DCD供肝的方法能明显减轻肝移植术后BEC损伤,从而改善大鼠肝移植预后,提高移植术后生存率。
陈亮[7]（2020）在《Treg细胞外泌体诱导移植肝免疫耐受的机制研究》文中指出[目的]优化提取方法,分离活化高质量、高增殖率的Treg细胞。证实Treg细胞除了通过直接接触抑制CD8+T细胞增殖外,也可以通过非接触方式抑制CD8+T细胞增殖。证实Treg细胞对CD8+T的抑制是可以通过exosomes实现的。Treg及其 exosomes 可通过 microRNA-194-1-3p 靶向 LAT1（Slc7a5）调控 mTOR 信号传导通路,影响氨基酸的转运,从而抑制CD8+T细胞增殖。建立SD大鼠供体,Wistar大鼠异体原位肝移植模型,通过动物体内实验证实Treg-exosomes对同种异体肝移植的保护作用。[方法]1、Treg细胞对CD8+T细胞功能和增殖影响:取BALB/C小鼠脾脏,分别采用磁珠吸附分选和流式分选Treg细胞。分离得到的Treg细胞通过CD3、CD28、IL-2单克隆抗体以及Rapamycin共同活化并扩增。CD8+T细胞采用磁珠吸附分选,通过CD3、IL-2单克隆抗体活化CD8+T细胞。采用Transwell系统及直接共培养Treg细胞和CD8+T细胞。采用CCK-8检测不同时间点CD8+T细胞增殖情况,以及通过PI染色分析CD8+T细胞细胞周期变化情况。2、Treg-exosomes对CD8+T细胞功能和增殖影响:收集Treg细胞上清液,分别采用exosomes提取试剂盒和超高速差速离心法两种方法提取exosomes,并通过western blot检测CD63表达,确定不同培养时间Treg细胞上清液不同提取方法中exosomes的含量。通过电镜分析以及粒径分析和western blot检测CD63、LAPMP-1蛋白表达三方法,共同鉴定提取的exosomes。构建绿色荧光蛋白（GFP）标记的CD63慢病毒,感染Treg细胞,并在荧光显微镜检测感染效率,提取带荧光的Treg-exosomes感染活化的CD8+T细胞,共聚焦荧光显微镜检测感染效率。按照下面分组进行干预细胞:a对照组:正常培养的CD8+T细胞;b共培养组:Treg细胞和CD8+T细胞组;c高剂量exosomes组:在CD8+T细胞中加入40ug Treg细胞来源的exosomes;d低剂量exosomes组:在CD8+T细胞中加入10ug Treg细胞来源的exosomes;e抑制剂Treg组:活化Treg细胞加入GW48692小时后与CD8+T细胞共培养;f抑制剂exosomes组:在CD8+T细胞中加入40ug Treg细胞来源的exosomes的同时加入GW4869。采用CCK-8检测不同时间点上面6组CD8+T细胞增殖情况及细胞周期变化情况,同时通过QPCR、Western blotting、流式细胞术检测CD8+T细胞分泌细胞因子IFNλ和Perforin的表达情况。3、Treg 细胞及其 exosomes 可通过 microRNA-194-1-3p靶向LAT1（Slc7a5）调控mTOR信号通路:收集Treg细胞和exosomes干预后CD8+T细胞,使用microRNA芯片检测筛选差异microRNA,并进行QPCR验证、靶基因预测、靶基因GO和KEGG分析。生物信息学预测网站预测microRNA-194-1-3p与LAT1（Slc7a5）的靶向关系,并通过双荧光素酶报告基因实验证实。mumics和inhibitor转染CD8+T细胞,QPCR检测mmu-miR-194-1-3p和Slc7a5基因的变化情况,mmu-miR-194-1-3p mimics 和 inhibitor 干预 CD8+T 细胞检测 CD8+T 细胞增殖情况。通过 western blot 检测 mmu-miR-194-1-3p的mimics 和 inhibitor 干预 CD8+T细胞后靶基因Slc7a5和p-mTOR蛋白表达情况。4、Treg-exosomes对同种异体肝移植保护作用:本实验通过Kamada“二袖套”法,建立Wistar大鼠异体原位肝移植模型,分为A、B两组,术后第4天开始均给予雷帕霉素,A组在第1、3、5天注射Treg细胞中提取的exosomes。术后3day、11day、18day尾静脉取血浆检查ALT、TBIL水平,同时观察存活时间。[结果]1、Treg细胞对CD8+T细胞功能和增殖抑制作用:流式细胞术鉴定流式分选和磁珠吸附分选Treg细胞CD4+CD25+Treg阳性比率分别为93.2%和87%,CD8+T细胞磁珠吸附分选阳性比率为91.44%。Treg细胞与CD8+T细胞共培养后CCK-8检测结果显示,无论是Transwell系统共培养还是直接共培养,CD8+T细胞增殖都显着下降（均P<0.05）。共培养后增殖周期检测结果显示,GO/G1期的CD8+T细比例显着增加,S期和G2/M期都表现出更少的富集细胞。2、Treg-exosomes对CD8+T细胞功能和增殖抑制作用:（1）Western Blot检测结果显示,聚合沉淀法提取的exosomes CD63表达明显高于超速离心法。透射电镜下观察exosomes是圆形或类圆形的,直径分布在30-150nm的范围内。Western Blot检测结果显示exosomes中CD63、LAPMP-1蛋白均呈阳性表达。荧光显微镜观察慢病毒感染Treg细胞,48h后显示荧光表达含量达到70%以上。共聚焦荧光显微镜可以观察到Treg-exosomes感染了 CD8+T细胞。（2）Treg-exosomes与CD8+T细胞共培养后,CCK-8检测CD8+T细胞增殖情况显示:Treg-exosomes与活化CD8+T细胞共培养后,CD8+T细胞的增殖明显降低,而且在高剂量exosomes组中抑制作用更为明显。而预先在Treg中加入了 GW4869抑制exosomes的分泌,结果显示Treg细胞对CD8+T细胞的抑制作用减弱了。流式细胞仪检测CD8+T细胞周期情况得到了相似的结果。（3）QPCR、Western blotting和流式细胞术检测perforin、IFN-γ。结果显示,Treg细胞以及高剂量exosomes干预CD8+T细胞后IFN-γ和Perforin蛋白表达明显下调（均P<0.05）,相比之下,Treg细胞加入GW4869后IFN-y和Perforin蛋白表达无明显变化。3、Treg 细胞及其 exosomes 通过 microRNA-194-1-3p靶向LAT1（S1c7a5）调控mTOR信号通路:基因芯片及QPCR验证Treg细胞及exosomes一致变化的有13个microRNA。双荧光素酶报告基因实验证实,mmu-miR-194-1-3p与S1c7a5基因3’-UTR靶向结合。细胞转染构建高表达miR-194-1-3p和低表达miR-194-1-3p的细胞株检测mRNA和蛋白水平表达的变化,结果提示miR-194-1-3p与Slc7a5、p-mTOR在CD8+T细胞中的表达呈直接负相关。高表达miR-194-1-3p可以显着抑制CD8+T细胞的增殖,G0/G1、G2/M期表现细胞显着增加而S期表现细胞显着减少。4、Treg-exosomes对同种异体肝移植保护作用:术后第3天时A组的ALT、TBIL水平较B组的低,但差别不大,第11天时两组的ALT、TBIL水平均有降低,但A组更为明显,两组之间有显着差异（P<0.05）。到第18天时两组的ALT、TBIL水平继续有降低,但仍然是A组降低更为明显（P<0.05）,两组之间有显着差异。注射Treg-exosomes大鼠存活时间明显延长。对照组（B组）在移植后有28天的中位存活时间,而Treg-exosomes治疗组（A组）的存活时间明显更长,达到90天。[结论]1、通过磁珠吸附分选得到的Treg细胞,在CD3/CD28单抗、雷帕霉素、IL-2刺激培养下,可以良好增殖。Treg细胞对CD8+T细胞的增殖具有明显抑制作用,Treg细胞对CD8+T细胞既可以通过细胞间直接接触,也可以通过非直接接触的方式抑制CD8+T细胞增殖。2、通过ExoQuick precipitation法可以提取到更多的Treg细胞exosomes,同时显示Treg细胞培养72h收集上清得到的exosomes量更多。Treg细胞可以被pCT-CD63-GFP慢病毒转染且标记其分泌的exosomes,并可以直观地观察到Treg分泌的exosomes转移并整合到CD8+T细胞内。Treg细胞可以通过分泌exosomes影响CD8+T细胞的细胞周期分布,抑制CD8+T细胞增殖,以及抑制其分泌穿孔素以及IFN-γ。3、Treg细胞及其分泌的exosomes可以通过miR-194-1-3p发挥其对CD8+T细胞的抑制作用。miR-194-1-3p可能通过靶向下调LAT1（Slc7a5）抑制mTOR信号传导通路,影响氨基酸的转运,从而抑制CD8+T细胞增殖。4、同种异体肝移植大鼠注射Treg细胞来源的exosomes后同,移植大鼠存活时间明显延长。Treg-exosomes在大鼠体内发挥免疫抑制作用需要一定的反应时间,且随着时间的推移有进一步扩大的趋势。
薛郑泽[8]（2020）在《PACAP在肝缺血再灌注损伤中的作用和机制研究》文中指出背景:作为一种非外源性抗体依赖的炎症反应,缺血再灌注损伤（ischemia and reperfusion injury,IRI）是器官获取、器官移植、部分器官切除、创伤及休克等临床实践中难以避免的重要并发症。在肝移植的临床实践中,早期阶段肝脏缺血再灌注损伤常引起肝脏的功能丧失以及功能障碍,同时可能增加急性与慢性排斥反应事件的发生风险,以至最终的移植物衰竭,而进一步加重我国移植供体短缺的现状。在缺血再灌注损伤的过程中,局部血供受阻,肝细胞能量代谢障碍、氧化应激产物的生产,外周中性粒细胞和巨噬细胞的聚集浸润几个过程相互作用,加重了组织损伤并成为导致器官功能丧失的主要原因。作为细胞饥饿状态下的应对措施,自噬通过溶酶体降解受损细胞器和畸形蛋白质,完成细胞内的自我消化,为饥饿的细胞提供必需的底物（氨基酸,脂质和游离脂肪酸）,以维持能量代谢和生物合成。由于肝脏富含溶酶体,因此自噬功能失调与多种肝脏疾病（肝脏IRI,非酒精性脂肪性肝炎和肝癌）有关。在肝移植中,热缺血和冷缺血均主要中断血流/氧气供应,消耗肝细胞三磷酸腺苷并产生活性氧（reactive oxygen species,ROS）。肝细胞的严重饥饿状态触发自噬信号传导,自噬激活后为细胞提供可重复使用的单体来维持细胞稳态。在IRI过程中,免疫系统与神经系统存在广泛互相作用并形成相互调节机制以维持动态平衡。IRI引起的炎症激活下丘脑系统性神经内分泌调节和区域性神经激素应激反应。神经调节通过刺激迷走神经活动来放大、监测和调节免疫反应,这是一个重要的反馈性回路;在刺激消除后,神经系统又会负性调节局部免疫反应以促进局部环境重回稳态。由ADCYAP1基因编码的垂体腺苷酸环化酶激活肽（pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide,PACAP）正是连接免疫与神经调节的桥梁。PACAP是血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptid,VIP）/胰高血糖素/分泌素家族的成员,在促体垂体区域起神经递质和神经调节剂的作用,并参与促性腺激素的旁分泌和自分泌调节。我们曾报道PACAP和其所有三种受体在IR应激肝脏中表达,并影响肝脏对IR损伤敏感性。而外源性PACAP神经肽也通过减少IR-肝中的中性粒细胞/巨噬细胞集聚和负性调控促炎症介质来调节局部先天性免疫。环磷腺苷效应元件结合蛋白（c AMP response element-bing protein,CREB）曾被报道在感染和胰岛素抵抗中发挥先天性免疫调控作用,通过调节的巨噬细胞极化分型消弱TLR4信号通路介导的炎症反应。我们之前也发现,PACAP可以通过增强c AMP-PKA通路与CREB活性来抑制巨噬细胞NF-κB活性。最近,报道称CREB在肝脏自噬调节中有促进脂质自噬降解的功能。Kruppel样因子4（Kruppel-like factor 4,KLF4）是KLF家族至关重要的调控自我更新的转录因子,在增殖、分化和体细胞重编程中发挥着多种调节作用。同时,KLF4通过与Stat6协同诱导M2相关基因表达,并弱化NF-κB激活因子抑制M1表型,对巨噬细胞的极化分型产生影响。另一方面,KLF4通过促进自噬而延长了线虫的寿命,改善小鼠的老年性血管功能障碍,并与CREB在结核分枝杆菌中协同调节免疫的功能引起了我们的研究兴趣。本研究试图阐明在模拟真实临床实践的延长肝冷藏时间后行同系小鼠原位肝移植手术模型中,PACAP介导自噬活动的对肝细胞保护作用,并探讨其在肝脏IRI中促进自噬活动对分子机制,为PACAP在肝移植临床实践中保护肝脏的应用提供理论支持。目的:本研究旨在通过模拟真实临床实践中肝脏供体经过长时间冷藏后行原位肝移植术的小鼠原位肝移植模型来探究PACAP介导肝细胞自噬对肝脏活性的影响与机制。课题假设外源性PACAP通过增强肝细胞内自噬活性,为IR刺激下营养障碍的肝细胞供给细胞代谢所需的底物与能量,以此发挥保护肝细胞的作用。首先,我们想知道PACAP神经肽是否以及如何通过自噬依赖的方式对长时间冷脏的肝脏起保护作用。随后,我们研究了PACAP介导的自噬是否可以在基于临床实践的小鼠原位肝移植模型中保持肝细胞的活力,并促进肝的再生/修复。最后,我们探讨了在肝脏IRI中,PACAP介导的CREB和KLF4共激活对促进肝细胞自噬活动起关键作用,并为将PACAP应用于肝移植的临床实践提供理论支持。方法:1.动物。8-12周雄性C57BL/6野生型小鼠（WT）。2.原位肝移植模型。将C57BL/6供体小鼠的肝移植物在4℃UW溶液中保存20 h,然后原位移植到同基因C57BL/6小鼠中。在进行肝移植时以及再灌注之前对受体组予以PBS、PACAP38,或3-甲基腺嘌呤（3-MA）处理。观察OLT术后存活,并在移植后6小时和24小时收集血清和OLT样品。3.部分肝脏热缺血再灌注损伤模型。用无创伤性夹子夹住肝头叶的动脉和门静脉（占全肝的70%血供）90分钟。单剂量PACAP38、CRP-CREB相互作用抑制剂（CREB抑制剂）或KLF4抑制剂（Kenpaullone）于热缺血前1小时静脉注射。再灌注后6小时收集缺血性肝组织和血清样品。4.肝细胞损伤与功能检测。测定小鼠血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平,用以对其进行肝脏受缺血再灌注损伤严重程度的评估。5.组织病理学。获取肝脏样本制成4μm标本,用H&E染色,对肝脏结构损伤情况进行双盲法分析。6.碘化丙锭（PI）染色。PI染色（Thermo Fisher）用于通过结合DNA检测死细胞。将红色荧光图像与明亮视野图像合并以进行盲目评估。7.Real time PCR。提取组织或细胞RNA,用PCR技术对肝脏细胞因子及趋化因子表达情况进行研究和分析,并对PACAP下游分子、自噬和再生修复相关基因进行检测,分析其表达状态。8.Western blot。提取组织或细胞蛋白质,用免疫印迹技术分析OLT模型及IRI模型中关键蛋白在细胞核与细胞质中表达的情况。9.免疫荧光染色。用于分析肝细胞LC3、p CREB和KLF4表的情况。10.ALT/LDH试验。测定体外原代肝细胞培养液中的ALT/LDH水平,用以测定体外培养的原代肝细胞的损伤情况。11.细胞培养。肝胶原酶灌注原位消化后,通过Percoll梯度离心分离原代肝细胞,然后在胶原蛋白包被的平板中培养。12.统计分析。所有实验中的结果均以平均值±标准差（SD）的形式进行表示。并认为p<0.05为有显着统计学意义的差异。结果:1.PACAP可减轻肝冷IRI并并提高小鼠原位移植术后生存率。首先,我们研究了在小鼠同系OLT模型中,给予PACAP神经肽能否对长时间冷藏后行原位肝移植术的供体肝脏其保护作用并延长移植物存活时间。与PBS对照组的41.7%存活率相比,PACAP给药组中91.7%的受体小鼠在OLT后14天仍然存活。由于冷IRI对肝细胞的损伤在再灌注后6h达到高峰,我们在6 h和24 h评估了OLT和血清样品。PACAP显着降低了IRI-OLT,表现为s ALT水平降低和肝脏组织学的完整。2.PACAP促进肝脏自噬。在IR损伤的肝脏中,PACAP增强肝细胞自噬活动。PACAP处理组中自噬关键成分（LC3,Beclin-1和Atg5）的表达量明显高于对照组。同样,PACAP神经肽增加了LC3的表达水平,降低了p62的水平,并促进LC3 I至LC3 II的转化,这被认为是自噬途径中的关键活性步骤。OLT术后6小时肝脏移植物中自噬体的电子显微照片也直观的印证了这个结果。3.PACAP在OLT模型中介导的细胞保护/再生作用依赖于自噬。接着,我们使用自噬抑制剂3-MA来阻断PACAP介导的肝自噬活性,从而验证其在肝脏体内稳态中的重要性。3-MA可阻断IR应激OLT中自噬体的形成。3-MA处理后,LC3I,LC3 II和Beclin-1表达下降,并恢重现OLT中的肝脏IRI,即s ALT水平升高与肝组织学的破坏。另外,我们发现PACAP介导的自噬对肝细胞再生功能有促进作用,提高了PCNA,Ki67,表皮生长因子（EGF）,肝细胞生长因子（HGF）及其受体c-Met的表达;而自噬抑制则消除了这种效果。4.PACAP介导的自噬可防止肝细胞死亡。在过氧化损伤模型中,PACAP处理增强肝细胞核和细胞质中LC3的诱导和积累,保护肝细胞免受氧化应激损伤而凋亡。而自噬抑制作用加剧了肝细胞在该模型中的损害。5.PACAP-CREB轴对于肝脏IRI中PACAP功能至关重要。正如我们在肝IRI中发现PACAP激活PKA-c AMP-CREB信号通路,我们在肝脏OLT中也检测到p CREB的激活,在原代肝细胞体外过氧化损伤模型中观察到一致的结果。不仅如此,我们在小鼠IRI模型中发现,抑制CREB功能可以消除PACAP介导对小鼠肝脏的保护作用。6.PACAP介导的肝细胞自噬需要CREB。相对于PACAP处理促进了肝脏IRI中的肝自噬,PACAP与CREB抑制剂共同给药后,在小鼠IRI模型和原代肝细胞氧化应激中均未能激活自噬相关基因的表达,这说明PACAP介导的肝细胞自噬是CREB依赖的。此外,CREB抑制剂消除了PACAP介导的肝细胞再生活动。7.PACAP-CREB信号通路在肝脏IRI中调控KLF4。与对照组相比,PACAP增强了肝脏IRI模型和体外肝细胞过氧化损伤中的KLF4基因的转录和蛋白质表达。然后,我们在肝IRI模型中使用KLF4抑制剂。与PACAP-CREB阻断类似,抑制KLF4减弱了PACAP介导的细胞保护作用,并恢复了IR诱导的肝细胞损伤,如升高的s ALT水平和肝病理损伤。此外,KLF4的阻断促进了被PACAP-CREB通路下调的促炎性细胞因子,也抑制保护性细胞因子IL-10的表达。8.KLF4对于PACAP-CREB介导的肝细胞自噬通路中不可或缺。KLF4阻断显着减少了肝IRI模型里PACAP处理组原本丰富的肝细胞自噬活动与再生活动。同样,原代肝细胞过氧化模型中PACAP介导的自噬活性和保护作用也被KLF4抑制剂消弱,出现肝细胞损伤与凋亡增加的现象。结论:1.在原位肝移植模型中,PACAP介导的肝细胞自噬活动具有提高肝移植存活率并减轻缺血再灌注损伤的作用。同时有助于提高OLT中肝细胞修复再生功能,减轻IR介导的细胞损伤,减少细胞凋亡/坏死。2.在缺血再灌注损伤中,PACAP通过CREB-KLF4信号通路调节肝细胞自噬功能,发挥对肝细胞的保护作用。同时,在IR肝脏中,PACAP-CREB-KLF4信号通路的完整性对自噬介导的肝细胞保护作用至关重要。
张黎[9]（2019）在《CaMKⅡγ在大鼠DCD肝移植缺血-再灌注损伤作用的研究》文中进行了进一步梳理第一部分大鼠CaMKⅡγ基因慢病毒载体的构建及鉴定[目 的]构建大鼠CaMKⅡγ基因的过表达及干扰慢病毒载体并鉴定,为下一步探讨慢病毒介导CaMKⅡγ基因干扰调控Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路及其在大鼠DCD肝移植缺血-再灌注损伤的作用提供基础。[方 法]根据大鼠CaMKⅡγ目的基因的mRNA序列,全基因合成CaMKⅡγ目的基因,构建大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒载体及CaMKⅡγ过表达慢病毒空载体,根据本课题组前期实验中已筛出的干扰效率最高的siRNA序列构建大鼠CaMKⅡγshRNA慢病毒载体及CaMKⅡγyshRNA慢病毒空载体,转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞并进行测序验证,随后转染293T细胞进行慢病毒包装并用绝对定量qPCR测定慢病毒滴度。应用Western Blot检测大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒载体的蛋白表达情况,确定大鼠CaMKⅡγ过表达的有效性。根据不同慢病毒转染大鼠肝细胞BRL-3A,将其分为生理盐水空白对照组（CON组）,CaMKⅡγ过表达慢病毒空载体组（CON-mCaMKⅡγ组）,CaMKⅡγ过表达慢病毒载体组（mCaMKⅡγ组）,CaMKⅡγ干扰慢病毒空载体组（CON-shCaMKⅡγ组）,CaMKⅡγ干扰慢病毒载体组（shCaMKⅡγ组）,应用Western Blot检测各组CaMKⅡγ蛋白表达情况。[结 果]成功构建了大鼠CaMKIIⅡγ过表达慢病毒载体及CaMKⅡγ过表达慢病毒空载体,Western Blot检测大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒载体蛋白的表达。根据已知干扰效率最高的siRNA序列成功构建大鼠CaMKⅡγshRNA慢病毒载体及CaMKⅡγshRNA慢病毒空载体。绝对定量qPCR测定大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒载体、大鼠CaMKⅡγshRNA慢病毒载体滴度均为2E+9TU/mL。不同慢病毒转染大鼠肝细胞BRL-3A 48h后,mCaMKⅡγ组的CaMKⅡγ蛋白表达最高,shCaMKⅡγ的CaMKⅡγ表达最低,mCaMKⅡγ组的CaMKⅡγ表达高于CON-mCaMKⅡγ组（P<0.01）,shCaMKⅡγ组的 CaMKⅡγ表达低于CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）。[结 论]大鼠CaMKⅡγ基因的过表达慢病毒在293T细胞中构建成功并表达,大鼠CaMKⅡγshRNA慢病毒载体在293T细胞中构建成功。大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒在大鼠肝细胞BRL-3A中蛋白表达显着增加,而大鼠CaMKⅡγ干扰慢病毒在大鼠肝细胞BRL-3A中的蛋白表达量显着下降,为后续研究CaMKⅡγ作为靶基因干扰调控Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路及在大鼠DCD肝移植术缺血-再灌注损伤的作用提供基础。第二部分建立SD大鼠DCD原位肝移植模型[目 的]建立稳定的SD大鼠DCD原位肝移植模型并确定在本课题后续实验中SD大鼠DCD原位肝移植模型的最佳热缺血时间。[方 法]本实验通过Kamada“二袖套”法,控制不同热缺血时间（热缺血Omin、热缺血15min及热缺血30min）建立SD大鼠DCD原位肝移植模型,并通过移植术后存活时间及肝脏变化确定本实验最佳动物模型热缺血时间。[结 果]供肝热缺血Omin、15min及30min的SD大鼠DCD原位肝移植模型术后7d的生存率分别为90%、80%及60%,随着热缺血时间延长,肝脏损伤加重,肝功能ALT、AST及TBIL逐渐升高,肝脏病理切片结果显示肝细胞从轻度水肿到点状坏死,再从桥接样坏死到大片状坏死。[结 论]在SD大鼠DCD原位肝移植模型中,热缺血时间的长短是直接影响供肝质量的关键因素,随着热缺血时间延长,供肝肝功能损伤逐渐加重,与病理结果一致,术后受体存活率随热缺血时间延长而显着下降。经过对比,热缺血15min是建立SD大鼠DCD原位肝移植模型并为后续进一步试验的理想造模时间,既可保证移植术后受体有一定的存活率,又可观察后续慢病毒干预对肝损伤是否有效。第三部分CaMKⅡγ在不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系[目 的]探讨CaMKⅡγ在不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系。[方 法]用第二部分建立的供肝热缺血Omin、15min及30min的SD大鼠DCD原位肝移植模型,三组分别于肝移植术后1d、3d及7d处死20只大鼠,取肝细胞行流式细胞术测Ca2+浓度水平、线粒体膜势能,Tunel法测肝组织中肝细胞的凋亡,Western Blot测肝组织中CaM、CaMKⅡγ及肝细胞质中AIF、CytC的蛋白水平表达,QRT-PCR测肝组织中CaMmRNA、CaMKⅡγmRNA,免疫组化测肝组织中CaM、CaMKⅡγ蛋白表达,探讨CaMKⅡγ在不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系。[结 果]三组移植术后1dCa2+水平达到高峰,术后3d Ca2+下降,到术后7d Ca2+又逐渐升高,同一时点,热缺血15min组及30min组Ca2+浓度水平高于热缺血Omin组（P<0.01）。JC-10标记绿色荧光细胞比例随时间延长逐渐升高,提示线粒体膜势能下降比例逐渐升高,术后1d,三组无统计学差异,术后3d,热缺血15min组及30min组绿色荧光细胞比例高于热缺血Omin组（P<0.05）,术后7d,热缺血15min组及30min组绿色荧光细胞比例高于热缺血Omin组（P<0.01）。Tunel检测肝细胞凋亡比例随时间延长逐渐升高,术后1d,热缺血30min组肝细胞凋亡比例高于热缺血Omin组（P<0.05）,热缺血15min组与热缺血Omin组无统计学差异,术后3d,热缺血15min组及30min组肝细胞凋亡比例高于热缺血Omin组（P<0.05）,术后7d,热缺血30min组肝细胞凋亡比例高于热缺血Omin组（P<0.05）且热缺血30min组肝细胞凋亡比例高于热缺血15min组（P<0.05）。Western Blot测CaaM、CaMKⅡγ、AIF及Cyt C蛋白表达随热缺血时间延长而逐渐增加（P<0.05,P<0.01）,同一时点,热缺血15min组及30min组的蛋白表达高于热缺血Omin组,QRT-PCR及免疫组化测CaMmRNA、CaMKⅡγmRNA及 CaM、CaMKⅡγ蛋白阳性率与 Western Blot 结果趋势大致相同。[结 论]热缺血时间是影响供肝质量的关键因素,SD大鼠DCD原位肝移植术后,供肝热缺血时间越长,供肝功能损伤越重,移植术后Ca2+浓度逐渐升高,从分子、蛋白及组织水平验证了随热缺血时间的延长,CaM及CaMKⅡγ表达增加,CaMKⅡγ作用于线粒体膜,线粒体膜势能下降细胞比例增加,AIF及CytC从线粒体内释放,线粒体凋亡增加,由线粒体凋亡引起的肝细胞凋亡随之增加。第四部分慢病毒介导CaMKⅡγ与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系[目 的]探讨慢病毒介导CaMKⅡγ与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系。[方 法]建立热缺血15min SD大鼠DCD原位肝移植模型,每只大鼠术中通过门静脉按1.0×108TU/mL注射CaMKⅡγ过表达及其对照慢病毒。（mCaMKⅡγ组、CON-mCaMKⅡγ组）、CaMKⅡγ干扰及其对照慢病毒（shCaMKⅡγ组及CON-shCaMKⅡγ组）、生理盐水（CON组）转染移植肝脏,于术后1d、3d、7d分别处死20只大鼠。取血清行肝功能检测,取肝细胞行流式细胞术测Ca2+浓度水平、线粒体膜势能,Tunel法测肝组织中肝细胞的凋亡,Western Blot测肝组织中CaM、CaMKⅡγ及肝细胞质中AIF、Cyt C的蛋白水平表达,QRT-PCR测肝组织中CaMmRNA、CaMKⅡγmRNA,免疫组化测肝组织中CaM、CaMKⅡγ的蛋白表达,电镜检测肝组织中肝细胞、线粒体的超微结构变化。[结 果]CaMKⅡγ过表达慢病毒组移植术后1d、3d及7d的生存率分别为83.3%、78.3%及70.0%,而CaMKⅡγ干扰慢病毒组移植术后1d、3d及7d的生存率分别为98.3%、93.3%及88.3%,提示干扰CaMKⅡγ的表达对大鼠DCD肝移植术后肝损伤是保护因素,可提高大鼠DCD肝移植术后生存率。肝功能结果示:血清 ALT、AST 术后各时点 mCaMKⅡγ组高于 CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组低于CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）,血清TBIL于术后1d各组无显着差异,术后3d及7d结果同血清ALT、AST。移植术后Ca2+浓度于术后1d达到高峰,各组间无显着差异,术后3d逐渐下降,术后7d再次升高,术后3d及7d,mCaMKⅡγ组高于 CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组低于 CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）。JC-10标记绿色荧光细胞比例在术后1d及3d,shCaMKⅡγ组绿色荧光细胞比例低于 CON-shCaMKⅡγ组（P<0.05,P<0.01）,术后 7d,mCaMKⅡγ组绿色荧光细胞比例高于 CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组低于 CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）。Tunel法测肝细胞凋亡结果示:术后1d、3d及7d,mCaMKⅡγ组肝细胞凋亡比例高于CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组肝细胞凋亡比例低于CON-shCaMKⅡγ组（p<0.01）。Western Blot 测 CaM、CaMKⅡγ、AIF 蛋白表达于术后 1d,mCaMKⅡγ组表达高于 CON-mCaMKⅡγ组（P<0.01,P<0.05）,术后 3d 及 7d,mCaMKⅡγ组表达高于CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组表达低于CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）,CytC蛋白表达于术后1d、3d及7d,mCaMKⅡγ组表达高于CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组表达低于 CON-shCaMKⅡγ组（P<0.05,P<0.01）。QRT-PCR 测 CaMmRNA、CaMKⅡγmRNA 的表达及免疫组化测 CaM、CaMKⅡγ蛋白阳性率与Western Blot结果趋势相同。电镜结果可见mCaMKⅡγ组出现超微结构损伤,肝细胞肿胀及坏死、线粒体肿胀、嵴消失,而shCaMKⅡγ组受损形态明显改善,肝细胞大致正常,线粒体或肝细胞轻微肿胀,CON组、CON-mCaMKⅡγ组、CON-shCaMKⅡγ组可见肝组织轻微的超微结构损伤,随时间推移,mCaMKⅡγ组损伤逐渐加重,shCaMKⅡγ组损伤逐渐减轻。[结 论]DCD供肝因缺血-再灌注损伤导致CaMKⅡγ异常表达,可通过激活Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路诱导线粒体损伤,上调CaMKⅡγ可使Ca2+水平升高,CaMKⅡγ作用于线粒体膜,使线粒体膜势能下降,线粒体通透性增加进而导致线粒体肿胀、破裂及凋亡,线粒体中AIF及Cyt C释放入细胞质可启动线粒体凋亡,进一步促进肝细胞凋亡;而下调CaMKⅡγ则可使Ca2+水平降低,减少线粒体膜势能下降,线粒体中AIF及Cyt C释放入细胞质减少,进而减少线粒体凋亡及其诱导的肝细胞凋亡,对SD大鼠DCD原位肝移植术后的肝功能损伤有保护作用。CaMKⅡγ过表达在DCD供肝因缺血-再灌注损伤导致的线粒体凋亡中起主导作用,特异性干扰CaMKⅡγ表达可特异性调控Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路,有效改善SD大鼠DCD原位肝移植术后肝损伤及提高术后移植大鼠存活率。
唐波[10]（2018）在《树鼩肝移植急性排斥反应中CXCL12/CXCR4作用的实验研究》文中指出第一部分树鼩原位肝移植模型的建立[目的]首次尝试用树鼩建立同种异体原位肝移植动物模型,为肝移植的临床及科学研究提供一种新型的,与人类基因型及免疫系统同源性更高,且更为经济实用的肝移植动物模型。[方法]在Kamada报道的“二袖套”法肝移植模型基础上加以改进,通过对总共60只树鼩进行随机分组为供体组和受体组进行同种异体原位肝移植实验,观察手术成功率,术后树鼩存活率,并行肝脏组织病理学检查,建立稳定的树鼩原位肝移植模型。[结果]定型手术成功率为90.00%（27/30）,树鼩24h存活率为76.67%（23/30）,3 天存活率为 60.00%（18/30）,1 周存活率为 30.00%（9/30）,最长存活时间为11天。3例手术失败原因为:肝上下腔静脉吻合口出血,麻醉过深,气胸死亡各1例。24h内死亡4例,其中1例因吻合口出血,1例吻合口血栓形成,2例死亡原因不明。术后存活超24h死亡23例,原因分别为急性排斥反应15例,占65.22%,其它为:胆道梗阻1例,腹腔感染2例,肝叶坏死1例,不明原因4例。[结论]1树鼩原位肝移植模型建立的难度及操作复杂性比大鼠肝移植更大,综合影响因素更多。合理的围手术期处理及娴熟的显微镜操作是影响肝原位移植模型手术成功的关键。2树鼩肝移植模型成功建立为本研究的创新点,目前未见报道,首次成功用树鼩建立了同种异体原位肝移植模型,作为一种新型动物肝移植模型的建立——改良“二袖套”法在树鼩原位肝移植模型的建立,模型稳定可靠,为今后将树鼩原位肝移植模型运用于肝移植的临床及基础研究奠定了基础。第二部分树鼩淋巴细胞CXCL12/CXCR4基因表达和迁移的体外实验研究[目的]研究雷帕霉素对树鼩外周血淋巴细胞趋化因子CXCL12（SDF-1）趋化功能及其受体CXCR4表达的影响,为移植排斥体内研究提供实验依据。[方法]实验分组:Rapacymin药物组、DMSO对照组和空白组。采用MTS细胞增殖实验,观察雷帕霉素对树鼩淋巴细胞存活及状态的影响;用细胞迁移运动实验检测雷帕霉素对人源性重组CXCL12所诱导树鼩淋巴细胞迁移能力的影响:使用Real-time PCR法检测雷帕霉素对树鼩淋巴细胞CXCR4基因的表达情况。[结果]雷帕霉素对树鼩淋巴细胞活力无显着影响,但对树鼩的淋巴细胞的迁移有抑制作用。同时雷帕霉素可下调树鼩淋巴细胞的CXCR4基因表达。[结论]趋化因子CXCL12及其受体CXCR4表达水平可影响淋巴细胞迁移,为树鼩肝移植急性排斥反应体内实验研究提供依据。第三部分树鼩肝移植急性排斥反应中CXCL12/CXCR4表达的作用及机制研究[目的]在肝移植模型建立的基础上加用免疫抑制剂及趋化因子受体阻止剂对趋化因子及其受体的作用进行实验研究。通过表达的差异性,阐明肝移植急性排斥中趋化因子/趋化因子受体（CXCL12/CXCR4）轴调控淋巴细胞迁移发挥的作用和机理等系列问题。为肝移植急性排斥反应发生机制提供重要依据,同时为临床有效的治疗和控制急性排斥反应,促进移植物存活提供实验数据和理论支持。[方法]1树鼩肝移植急性排斥反应模型建立,方法同第一部分。2实验分组;（1）对照组,A组（n=25）:正常树鼩作为对照;（2）排斥组,B组（n=25）:树鼩同种异基因肝移植组;（3）AMD3100组,C组（n=25）:树鼩同种异基因肝移植静脉注射AMD3100,1mg/kg/day;（4）雷帕霉素（Rapacymin,RAPA）抑制组,D组（n=25）。术后1、3、5、7d随机处死5只,收集血液、肝脏、脾脏标本。留下5只观察生存期,绘制生存曲线。3 实验室常规指标测定:收集各组肝移植术后1d,3d,5d,7d的血清,使用血液全自动生化分析仪测定TP,ALT,AST,TB水平。4流式细胞仪检测淋巴细胞CXCR4:分别在肝移植术后1d,3d,5d,7d,收集脾脏淋巴细胞,进行分离、培养,流式细胞检测。5移植物组织形态及病理学检测:免疫组织化学染色（IHC）检测并分析CXCL12的表达情况。肝组织HE染色病理学检查,根据Banff评分系统判断排斥反应程度。6酶联免疫吸附法（ELISA）检测血浆中CXCL12（SDF-1）蛋白量。7组织蛋白印迹（Western blot）分析与检测各组移植肝的CXCR4蛋白表达情况。[结果]1 C、D组树鼩移植后中位生存时间明显长于B组,差异有显着意义（P<0.05）,各组与 A 组比较,（P<0.05）。2树鼩肝移植术后实验室常规检查指标:对比各组树鼩肝移植术后1d,3d,5d,7d的相关指标。血清TP同时间点各组之间相比较,B、C、D组明显低于A组,差异有显着性（P<0.05）。而1d时,B、C、D,TP开始下降,但三组间比较,无显着性差异（P>0.05）。B组呈持续性下降,而C、D组术后5d、7d随着时间延长,开始恢复,呈上升趋势,C、D组5d,7d时点与B组比较,差异有显着性（P<0.05）。D组3d后,TP上升略高于C组,但两组统计无差异（P>0.05）。B组,C组,D组术后血清TB,ALT,AST,急剧上升,与A组在1d,3d,5d,7d同期比较,明显高于A组,差异有显着性（P<0.05）。B组持续性升高,而C、D组术后5d、7d随着时间延长,肝功能开始恢复,略有上升趋势,但较平缓,C、D组5d,7d时点与B组比较,差异有显着性（P<0.05）。而1d时,B、C、D三组间比较,无显着性差异（P>0.05）。3外周脾淋巴细胞流式细胞检测:术后1d、3d,B、C、D组间脾脏淋巴CXCR4表达无明显差异（p>0.05）,与A组有显着性差异（P<0.05）。术后5d、7d各时间点,C、D组明显低于B组,差异有显着性（P<0.05）。4移植肝脏形态学检测:采用Banff分级对移植肝脏AR的程度进行分级,A组术后各时间点,移植肝脏组织结构正常;B、C、D组1d肝小叶结构基本完好,肝细胞基本无变性、坏死,汇管区仅有少许炎性细胞浸润,未发生排斥;B组移植术后Id排斥不明确,在术后第3、5、7 d分别发生了轻度（Ⅰ级）、中度（Ⅱ级）、重度（Ⅲ级）排斥;C、D组术后3天到10天内,有少数发生了轻度AR。B组与C,D组同期比较排斥反应更为严重（P<0.05）。B组,术后3d可有明确的急性排斥反应发生。5免疫组化检测肝脏CXCL12表达:术后第7d B组CXCL12在肝脏细胞表达最高,C组、D组肝细胞CXCL12表达少,C组、D组与B组比较有显着性差异（P<0.05）。A组正常组织也有较少量的CXCL12表达,但与B组、C组、D组比较有显着性差异（P<0.05）。6酶联免疫吸附法检测树鼩外周血浆中CXCL12蛋白的表达:肝移植后`d,B组,C组,D组血清CXCL12表达相互比较均无明显差异（P>0.05）,与A组相比有显着差异（P<0.01）。移植术后3d,B组血清中CXCL12快速上升,与术前`d的表达水平相比较,有显着差别（P<0.05）,并随时间上调。C组、D组表达水平在术后5d,7d天上升缓慢,与B组同时间点比较表达水平低（P<0.05）。CXCL12蛋白的表达变化与RAI呈正相关,相关系数（r）为0.880。7 Western蛋白印迹分析检测:术后第1d各组树鼩移植肝内CXCR4蛋白表达无明显差异（P>0.05）。而术后第3d、5d、7d各时段A组、C组、D组树鼩淋巴细胞表达CXCR4蛋白明显低于B组（P<0.05）。C组、D组术后CXCR4蛋白表达高于A组（P<0.05）,而C组、D组两组之间第3d、5d、7d 比较CXCR4蛋白表达差异不明显（P>0.05）。[结论]1树鼩与人同源性较好,可用人的相关试剂应用在树鼩实验研究上,本实验研究结果的可靠性,进一步证实树鼩肝移植模型可应用于肝移植的系列实验研究中,并具有物种的优越性和价值。2树鼩肝移植模型急性排斥反应研究证实,正常肝组织有CXCL12表达,急性排斥时,可与CXCR4协同发生淋巴细胞、炎性细胞迁移至移植物,引起移植肝功能不全或受损。3趋化因子受体抑制剂AMD3100可阻断CXCL12/CXCR4轴在肝移植排斥中的作用,抑制T淋巴细胞向移植物浸润,减轻急性排斥反应。4雷帕霉素可抑制CXCL12人重组蛋白诱导的树鼩淋巴细胞迁移。其相关可能的机制为:雷帕霉素可下调CXCL12的激活与表达,并影响CXCR4受体的表达,以调控CXCL12/CXCR4信号通路所介导的淋巴细胞的运动能力,发挥其免疫抑制作用。5肝移植后CXCL12/CXCR4的表达水平与急性排斥反应的程度密切相关,表达水平与排斥反应强度有关,可评估免疫排斥反应状态。6 CXCL12血清中持续高表达可较敏感地预示肝移植急性排斥发生。检测血清CXCL12表达可作为一种无创的、敏感的早期诊断肝移植急性排斥反应的方法,为临床监测和诊断提供参考依据。并且可通过CXCL12的表达水平在一定程度上预测排斥反应的严重程度和判断抗排斥反应的治疗效果。
二、大鼠原位肝移植研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大鼠原位肝移植研究进展（论文提纲范文）
（1）转录因子YY1在大鼠肝移植急性排斥反应中的作用研究（论文提纲范文）
| 附录 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 YY1 参与大鼠原位肝移植急性排斥反应 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 YY1 过表达质粒通过促进Th17 的分化参与大鼠急性排斥反应的作用研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 肝移植中树突状细胞作用的研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）SD大鼠自体原位肝移植缺血再灌注损伤后粪便菌群的变化规律（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 肠道微生物与肝病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（3）HO-1通过抑制p38 MAPK激活减轻大鼠DCD肝移植缺血再灌注损伤（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 大鼠HO-1和HO-1 shRNA腺相关病毒载体的构建及转染效果验证 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 大鼠心脏死亡供体原位肝移植缺血再灌注损伤模型的建立 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 HO-1通过抑制p38 MAPK激活减轻大鼠DCD肝移植缺血再灌注损伤 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 微小RNA在肝脏缺血再灌注损伤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（4）抑制Kupffer细胞中SCIMP蛋白活性诱导大鼠肝移植免疫耐受的机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表论文 |
（5）肝脏异种移植后CD47-SIRPα不兼容介导血细胞吞噬作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肝脏移植 |
| 1.1.1 肝脏移植的概况 |
| 1.1.2 肝脏移植发展面临的难题 |
| 1.2 肝脏异种移植 |
| 1.2.1 肝脏异种移植供体选择 |
| 1.2.2 转基因猪与肝脏异种移植 |
| 1.2.3 肝脏异种移植的瓶颈 |
| 1.3 肝脏异种移植血小板减少的作用机制研究进展 |
| 1.3.1 体内移植模型 |
| 1.3.2 体外灌注模型 |
| 1.3.3 体外实验 |
| 1.4 CD47-SIRPA信号通路与异种移植 |
| 1.4.1 CD47-SIRPα信号通路 |
| 1.4.2 CD47-SIRP α信号通路维持血细胞稳态 |
| 1.4.3 CD47-SIRP α信号通路参与肿瘤发生发展 |
| 1.4.4 CD47-SIRP α信号通路介导异种细胞移植排斥 |
| 1.4.5 CD47-SIRP α信号通路与异种器官移植 |
| 1.5 本课题的立题依据 |
| 第2章 小鼠原位肝移植模型的建立与优化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要实验设备 |
| 2.2.3 主要手术器械和材料 |
| 2.2.4 主要实验试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 手术前准备 |
| 2.3.2 供体手术(图2.1) |
| 2.3.3 供肝修整(图2.2) |
| 2.3.4 受体手术 |
| 2.3.5 术后管理 |
| 2.3.6 苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,H&E)染色 |
| 2.3.7 统计方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 无肝期时间是手术成功的先决条件 |
| 2.4.2 手术后死亡原因分析 |
| 2.4.3 小鼠品系及胆道支架是小鼠肝移植术后远期生存的主要制约因素 |
| 2.4.4 通过优化供体品系及胆道支架达到满意的远期预后 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 肝脏器官移植后CD47-SIRPA不兼容介导血细胞吞噬的作用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 主要实验设备 |
| 3.2.3 主要实验试剂和材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 小鼠血小板及红细胞CD47表达检测 |
| 3.3.2 小鼠原位肝移植 |
| 3.3.3 红细胞计数 |
| 3.3.4 血小板计数 |
| 3.3.5 肝脏组织获取及固定 |
| 3.3.6 免疫荧光 |
| 3.3.7 HE染色 |
| 3.3.8 统计方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 肝脏移植后,CD47-SIRP α不兼容不能诱发贫血及严重的血小板减少 |
| 3.4.2 肝脏移植后,CD47-SIRP α不兼容产生的血小板减低不影响小鼠的存活 |
| 3.4.3 肝脏移植后,CD47-SIRP α不兼容不能诱发肝脏吞噬血小板 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 异种肝脏移植后CD47-SIRP A不兼容介导血细胞吞噬的作用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 主要实验设备 |
| 4.2.3 主要实验试剂和材料 |
| 4.2.4 主要的流式检测抗体 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 小鼠血小板及红细胞CD47表达检测 |
| 4.3.2 大鼠-小鼠异种原位肝移植 |
| 4.3.3 红细胞计数 |
| 4.3.4 血小板计数 |
| 4.3.5 密度梯度离心法分离小鼠外周血单个核细胞(PBMC) |
| 4.3.6 小鼠血清分离 |
| 4.3.7 移植肝非实质细胞分离 |
| 4.3.8 小鼠脾脏单细胞悬液的制备 |
| 4.3.9 血小板流式检测 |
| 4.3.10 PBMC、脾脏单细胞悬液、肝非实质细胞流式细胞检测 |
| 4.3.11 HE染色 |
| 4.3.12 小鼠谷丙转氨酶(ALT)检测 |
| 4.3.13 统计方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 大鼠-小鼠异种原位肝移植可作为异种肝移植的小动物模型 |
| 4.4.2 大鼠-小鼠异种原位肝移植术后产生强烈的排斥反应 |
| 4.4.3 大鼠-小鼠异种肝移植后排斥反应主要为T细胞介导的排斥反应 |
| 4.4.4 大鼠-小鼠异种肝移植后CD47-SIRP α不兼容对血细胞的吞噬作用 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 本研究主要创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得成绩 |
| 致谢 |
（6）HO-1基因修饰的BMMSCs联合常温机械灌注保存DCD供肝对大鼠移植肝中胆管上皮细胞的保护作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、BMMSCs的提取及Ad-HO-1 基因转染的BMMSCs的制备 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验动物及材料 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.1.3 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 BMMSCs的提取、培养和鉴定 |
| 1.2.2 Ad-HO-1/BMMSCs的制备和鉴定 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、建立稳定的体外NMP系统装置和大鼠原位肝移植模型 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验动物及材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 体外NMP系统装置的鉴定 |
| 2.2.2 成功建立DCD供肝的原位肝移植模型 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、Ad-HO-1/BMMSCs联合NMP 对大鼠胆管上皮细胞保护作用的研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验动物及材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 移植术后各组大鼠胆管形态学检测 |
| 3.2.2 移植术后各组大鼠胆管中CK19蛋白检测 |
| 3.2.3 移植术后各组大鼠移植肝中BEC凋亡相关检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 机械灌注减轻DCD肝移植术后胆道并发症的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）Treg细胞外泌体诱导移植肝免疫耐受的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 Treg细胞对CD8~+T细胞功能和增殖影响的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 Treg细胞来源的exosomes对CD8~+T细胞功能和增殖影响的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 Treg及其exosomes可通过microRNA-194-1-3p靶向LAT1 (Slc7a5)调控mTOR信号传导通路 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 Treg细胞对同种异体原位肝移植影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Treg细胞及其来源的exsomes与移植免疫耐受 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（8）PACAP在肝缺血再灌注损伤中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 PACAP在肝移植模型中的作用 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料和方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 第二部分 PACAP介导肝细胞自噬在肝缺血再灌注中保护作用的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料和方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 综述 垂体腺苷酸环化酶激活肽研究概况 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（9）CaMKⅡγ在大鼠DCD肝移植缺血-再灌注损伤作用的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 大鼠CaMKⅡγ基因慢病毒的构建及鉴定 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 建立SD大鼠DCD原位肝移植模型 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 CaMKⅡγ在不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 慢病毒介导CaMKⅡγ与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（10）树鼩肝移植急性排斥反应中CXCL12/CXCR4作用的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 树鼩原位肝移植模型的建立 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 树鼩淋巴细胞CXCL12/CXCR4基因迁移和表达的体外实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 树鼩肝移植急性排斥反应中CXCL12/CXCR4表达的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
四、大鼠原位肝移植研究进展（论文参考文献）
- [1]转录因子YY1在大鼠肝移植急性排斥反应中的作用研究[D]. 洪丽萍. 福建医科大学, 2021(02)
- [2]SD大鼠自体原位肝移植缺血再灌注损伤后粪便菌群的变化规律[D]. 朱宏伟. 昆明医科大学, 2021(02)
- [3]HO-1通过抑制p38 MAPK激活减轻大鼠DCD肝移植缺血再灌注损伤[D]. 严启航. 昆明医科大学, 2021(01)
- [4]抑制Kupffer细胞中SCIMP蛋白活性诱导大鼠肝移植免疫耐受的机制研究[D]. 吴皓. 重庆医科大学, 2020(01)
- [5]肝脏异种移植后CD47-SIRPα不兼容介导血细胞吞噬作用的研究[D]. 李婷. 吉林大学, 2020(01)
- [6]HO-1基因修饰的BMMSCs联合常温机械灌注保存DCD供肝对大鼠移植肝中胆管上皮细胞的保护作用[D]. 侯宾. 天津医科大学, 2020(06)
- [7]Treg细胞外泌体诱导移植肝免疫耐受的机制研究[D]. 陈亮. 昆明医科大学, 2020(02)
- [8]PACAP在肝缺血再灌注损伤中的作用和机制研究[D]. 薛郑泽. 浙江大学, 2020(01)
- [9]CaMKⅡγ在大鼠DCD肝移植缺血-再灌注损伤作用的研究[D]. 张黎. 昆明医科大学, 2019(05)
- [10]树鼩肝移植急性排斥反应中CXCL12/CXCR4作用的实验研究[D]. 唐波. 昆明医科大学, 2018(05)