一、Expression, purification of a synthetic fuse-protein-TSF from PF4 and TSP1 fragments and its effect on angio-genesis and tumor growth（论文文献综述）
张文君[1]（2021）在《EFEMP1与IZUMO1的相互作用及对受精的影响》文中指出哺乳动物在有性生殖的过程中发生受精作用,其中最关键的步骤是精子与卵子细胞膜的融合。精卵膜融合以精子和卵子表面的多个蛋白质分子相互作用为基础。目前已知精卵膜融合所需的蛋白质相互作用中,最重要的是精子表面的IZUMO1和卵子表面的JUNO之间的相互作用。但仅有IZUMO1和JUNO间的相互作用还不足以促使精卵完成细胞膜融合,这一过程应该还需要许多相关分子与IZUMO1和JUNO相互作用。为了鉴定同IZUMO1和JUNO存在相互作用的蛋白及其对精卵融合的影响,本文用酵母双杂交技术和免疫共沉淀技术鉴定了大鼠EFEMP1与IZUMO1的相互作用,通过间接免疫荧光技术观察了EFEMP1在小鼠睾丸、卵巢、精子和卵子中的定位,以及与IZUMO1在大鼠和小鼠精子上的共定位,最后利用体外授精技术测定了经EFEMP1抗体处理后小鼠精卵的受精率改变,评估EFEMP1在精卵膜融合过程中的作用。首先克隆了大鼠efemp1的cDNA,构建pGAD-efemp1酵母表达载体,分别与实验室保存的p GBK-Izumo1以及p GBK-juno酵母表达载体进行酵母双杂交,结果表明EFEMP1与IZUMO1存在相互作用,与JUNO不存在相互作用。构建p CMV-Flag-efemp1真核表达载体,与实验室保存的p CMV-HA-Izumo1真核表达载体共转染293 T细胞,进行免疫共沉淀实验,结果表明EFEMP1与IZUMO1存在相互作用。构建pET-28a-efemp1原核表达载体,转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞,诱导表达并分离纯化EFEMP1-HIS融合蛋白,免疫昆明白小鼠,获得小鼠抗EFEMP1-HIS腹水多克隆抗体,并验证其特异性。以自制的EFEMP1-HIS腹水多克隆抗体作为一抗进行间接免疫荧光实验,观察EFEMP1在睾丸、卵巢、精子和卵子中的定位;以自制的EFEMP1-HIS腹水多克隆抗体和实验室保存的兔抗IZUMO1-GST血清多克隆抗体共同作为一抗进行间接免疫荧光实验,观察EFEMP1和IZUMO1在大鼠精子和小鼠精子中的共定位。结果表明,EFEMP1表达于小鼠睾丸组织肌样细胞的细胞质和各发育阶段精子细胞的细胞质中,表达于小鼠卵巢组织中卵泡细胞的细胞质中以及卵子的细胞质中和细胞膜上;EFEMP1定位于顶体反应前后大鼠精子和小鼠精子的头部和尾部前半段,小鼠MII期卵母细胞的细胞膜上和细胞质中;EFEMP1和IZUMO1共定位于顶体反应后大鼠精子的头部以及顶体反应前小鼠精子的头部。通过体外授精实验观察并对比不做处理的小鼠精卵、经小鼠腹水处理后小鼠精卵以及经EFEMP1腹水多克隆抗体处理后小鼠精卵的受精率。结果表明,经EFEMP1腹水多克隆抗体处理后,小鼠精卵的受精率略低于经小鼠腹水处理后小鼠精卵的受精率,两者均略低于不做处理的小鼠精卵的受精率,但这三组的精卵受精率的差异不显着。本文验证发现EFEMP1与IZUMO1存在相互作用,EFEMP1与JUNO不存在相互作用;发现EFEMP1在小鼠的睾丸组织、卵巢组织以及在顶体反应前后大鼠精子和小鼠精子中的定位,以及EFEMP1和IZUMO1在顶体反应后大鼠精子和顶体反应前小鼠精子的头部存在共定位;经EFEMP1抗体处理后小鼠精卵的受精率略有下降,但其受到的影响不显着。
王继红,于光远,姜颖[2]（2021）在《凝血酶敏感蛋白-1与血管新生》文中研究指明凝血酶敏感蛋白-1（Thrombin-sensitive protein,Thrombospodin-1,TSP-1）是在人体中首先被发现的、由3条分子量约为145kDa的相同肽链组成的同源三聚体,其多个片段与血管新生以及细胞迁移、黏附、侵袭、凋亡等过程有关.TSP-1的结构域可与多种细胞表面受体分子相互作用,因而具有多种功能.TSP-1通过抑制生长因子与受体结合,或与血管内皮细胞表面多种黏附分子结合抑制肿瘤的血管新生,进而控制肿瘤的发生与发展,也有研究证明来源于TSP-1的多肽片段同样具有抗血管新生和抗肿瘤功能.对人源TSP-1的结构、受体及抗血管新生功能进行了综述,以期为以TSP-1为基础的血管新生抑制剂研究提供参考.
王炜烨[3]（2020）在《细粒棘球绦虫TSP8、TSP11基因的原核表达及免疫学初步分析》文中指出目的:细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus,E.g）作为包虫病（hydatidosis）的主要病原体,给我国及世界各国造成了不计其数的危害,给人民群众造成了巨大的生命威胁。自了解包虫病以来,各国均采取积极手段研究对其的防治,因此包虫病的免疫预防就成为了当前研究的热点。基于此,研制针对宿主的包虫病长效保护疫苗,将对我国包虫病的防治起到促进作用。而截至目前,四跨膜蛋白（Tetraspanin,TSP）在广泛的细胞活动过程中起到重要作用,并已发现可对寄生虫宿主免疫互作及逃避起到积极作用,已经被发现可作为多种寄生虫宿主疫苗的候选蛋白。本研究将首次对E.g四跨膜蛋白TSP8、TSP11基因进行扩增及原核表达,并对其重组蛋白免疫小鼠体内的细胞因子及抗体水平进行检测,为研究四跨膜蛋白作为细粒棘球绦虫候选疫苗抗原奠定基础。方法:（1）细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11全长基因的克隆及序列分析根据NCBI GeneBank中细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11的全长基因,分别对其设计特异性引物,以细粒棘球绦虫的原头蚴cDNA为PCR模板进行扩增,并将PCR产物克隆至pMD19-T载体,送至测序,通过生物信息学软件分析预测TSP8、TSP11全长基因的结构与功能,并通过SYBR GreenⅠqRT-PCR方法分析TSP8、TSP11基因在E.g原头蚴以及成虫mRNA相对转录情况。（2）细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11主要抗原基因的克隆及原核表达为成功编码表达细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11基因,针对其主要抗原区域序列进行了特异性引物设计,对主要抗原区域片段进行克隆并测序。在测序正确的基础上,将目的片段与表达质粒pET-32a分别进行酶切与连接以及转化,建立pET-32a-TSP重组表达载体,并使用亲和层析柱法对其进行纯化、SDS-PAGE电泳对其进行鉴定及检测、Western blot免疫印迹法对其抗原性进行检测、以及通过免疫定位分析TSP8、TSP11蛋白在虫体的具体定位。（3）细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11免疫学特性分析试验分为4组,重组蛋白TSP8、TSP11组与PBS、佐剂对照组,每组共15只小鼠,分别对试验组进行免疫,以每只小鼠500μg蛋白含量与弗氏佐剂进行等体积混合免疫,每隔15天免疫一次,共免疫4次。第一次免疫为弗氏完全佐剂混合免疫,其余为弗氏不完全佐剂混合免疫。每次免疫后,各组取三只小鼠尾部采血并收集血清,以q-PCR方法测定Th1型（IFN-γ、TNF-β）、Th2型（IL-4、IL-5、IL-6、IL-10）两类免疫反应共6种细胞因子随免疫时间的变化、以及采用ELISA法测定其抗体水平的变化。结果:1、成功克隆到细粒棘球绦虫TSP8基因全长序列,TSP8基因共含有669个核苷酸,编码蛋白含222个氨基酸,相对分子质量为24 KDa。预测TSP8基因共含有2个潜在的N端糖基化位点,包含2个蛋白激酶磷酸化位点。编码TSP8基因的氨基酸序列共含有5个跨膜区域,推测含有4个优势B抗原表位,且qRT-PCR结果显示TSP8基因在E.g原头蚴及成虫阶段均有表达,但在成虫阶段的表达水平较高,具有统计学差异（p<0.05）。2、经克隆获得TSP11全长基因,TSP基因全长765个核苷酸,编码蛋白含254个氨基酸,相对分子质量为29.02KDa,预测其含有3个潜在的N端糖基化位点、5个蛋白激酶磷酸化位点以及1个酪氨酸激酶磷酸化位点。编码TSP11基因的氨基酸序列共含有3个跨膜区域,推测含有7个优势B抗原表位。qRT-PCR显示其在E.g原头蚴及成虫阶段均有表达,无统计学显着差异（P>0.05）。3、重组蛋白Eg-TSP8、Eg-TSP11在免疫小鼠2周时,就可在小鼠血清中检测出特异性IgG抗体,并发现在随后的加强免疫中,血清中的特异性IgG抗体水平逐次升高,表明该重组蛋白能诱导小鼠体内产生特异性的抗体,具有比较好的免疫原性。重组蛋白Eg-TSP8在首免2周后,检测到脾组织中IL-5、IL-10相对于佐剂组与PBS组有较高水平表达（P<0.01）。而重组蛋白Eg-TSP11在第三次加强免疫后,能在脾组织中检测到细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-10水平,均比佐剂组与PBS有显着高水平表达（P<0.01）。可见,重组蛋白Eg-TSP11诱导小鼠产生了Th1/Th2免疫反应,而重组蛋白Eg-TSP8主要偏向于Th2免疫反应。结论:重组蛋白Eg-TSP8、Eg-TSP11均具有免疫原性,但Eg-TSP11蛋白相较于Eg-TSP8蛋白能刺激小鼠产生Th1型免疫应答,具有成为包虫病候选疫苗抗原的潜力。
宋佳蕾[4]（2019）在《天然产物flavaglines对红白血病的抑制作用及机制研究》文中进行了进一步梳理Fli-1是ETS转录家族的成员之一,参与调节癌症的起始和进程,包括:无限增殖、造血作用、基因组不稳定性、抑制凋亡和阻滞分化,其不正常表达或易位能诱导多种类型肿瘤的发生。尤为重要是,已有研究证据表明Fli-1调控造血干细胞和造血祖细胞的分化,高表达Fli-1的免疫细胞其微环境有助于白血病细胞的体内外扩增。因此,本研究课题基于Fli-1作为一个抗肿瘤的潜在治疗靶点,从天然产物提取物来源的化合物中筛选出具有Fli-1抑制作用的小分子先导化合物,并采用红白血病细胞和F-MuLV诱导的红白血病小鼠模型对其进行抗红白血病活性的初步评价。经过筛选,本研究获得一组在体内外均具有显着抗红白血病活性的flavagline类化合物4′-demethoxy-3′,4′-methylenedioxy rocaglaol（A1544）和rocaglaol（A1545）;进一步从诱发细胞凋亡和促进细胞分化等方面阐明flavagline类化合物对红白血病的抑制作用,并解释其中可能参与的分子机制。主要研究内容和结果如下:（1）A1544和A1545抑制肿瘤活性上的表现:A1544和A1545抑制了高表达Fli-1细胞株CB7、HEL、Daudi、MM1.S和RPMI8226的增殖作用。我们发现A1544和A1545阻滞小鼠和人红白血病细胞细胞周期由G0/G1期向S期的转化。在红白血病小鼠模型中,A1544和A1545延缓了红白血病小鼠的发病进程。（2）Fli-1敲减的HEL、Daudi、MM1.S和RPMI8226细胞生长增殖受到抑制,Fli-1沉默HEL细胞株出现凋亡现象。A1544和A1545在转录后水平抑制Fli-1的表达,A1544和A1545能通过下调Fli-1表达抑制红白血病细胞的生长增殖。（3）A1544和A1545降低了红白血病细胞的线粒体膜电位,诱导红白血病细胞发生凋亡。A1544和A1545导致细胞凋亡可能的一条路径是化合物作用于红白血病细胞后,促凋亡蛋白bax上调和抑凋亡蛋白BCL2下调,引起线粒体膜电位降低,进一步caspase 9活化形成cleaved caspase 9,然后召集并激活形成cleaved caspase 3并作用于PARP1,激活细胞内部线粒体凋亡途径。A1544和A1545也下调caspase8从死亡受体路径诱导红白血病细胞凋亡,同时下调两条凋亡路径的连接蛋白bid。（4）分析A1544和A1545在红白血病细胞红系分化上的表现:这两个小分子先导化合物上调了红系分化相关因子EKLF、β-globin、GATA1、SHIP1、p27KIP1、NFE2基因的表达,但不影响巨核系分化相关基因p21CIP1和PF4基因的表达。采用流式细胞方法分析A1544和A1545处理的HEL细胞,红系分化表面抗原CD71的表达增加,巨核细胞和血小板表面抗原CD41的表达几乎没有变化。类似的结果也在红白血病小鼠体内实验出现,A1544和A1545不同程度地增加了小鼠脾细胞中CD71或TER119的表达。（5）对信号通路方面的影响:A1544和A1545作用于c-Raf-MEK1/2-ERK1/2通路,下调了MNK1介导的eIF4E磷酸化。A1544和A1545下调survivin的表达与eIF4E的失活有关。综上所述,本课题基于治疗靶点Fli-1,筛选鉴定出可用于潜在治疗白血病的小分子flavagline类化合物4′-demethoxy-3′,4′-methylenedioxy rocaglaol（A1544）和rocaglaol（A1545）,并进一步研究其抗红白血病活性的分子机制,为红白血病的治疗药物研发提供研究基础和临床前指导。同时,本课题也初步验证了Fli-1作为红白血病治疗靶点的可行性和有效性,并发现Fli-1参与了红白血病细胞的增殖,flavagline类化合物或其他Fli-1抑制剂有望应用于高表达Fli-1的多种类型肿瘤的治疗。
王超雨[5]（2019）在《新型全人源化CD47单抗抗白血病效应及调控CD47表达的机制研究》文中进行了进一步梳理研究目的:急性髓细胞白血病（AML,Acute myeloid leukemia）是急性白血病中最常见的一种疾病类型,发病率随着年龄的增加而增加。虽然有些患者对于化疗很敏感,但是由于AML高度异质性以及老年患者合并症的存在导致多数患者长期生存偏差。AML患者难治/复发的根源在于患者体内存在白血病干细胞或者微小残留病灶,控制甚至治愈AML的途径应该是清除患者体内白血病干细胞。因此,临床迫切期望高效低毒副作用的新药出现,为临床医师的临床用药选择提供更多的帮助。CD47,也称为整合素相关蛋白,属于免疫球蛋白超家族成员,分子量大小约为50kDa,是广泛表达于各种细胞膜表面的跨膜蛋白。CD47可以与信号调节蛋白α（SIRPα,signal regulatory proteinα）、血小板反应蛋白1（TSP-1,thrombospondin-1）、TSP-2结合介导许多细胞功能,包括白细胞黏附和迁移、T细胞活化、凋亡和吞噬等。其中CD47与SIRPα结合介导的抑制吞噬细胞吞噬活性尤为重要。CD47免疫检查点抑制剂（CD47靶点单克隆抗体）可以阻断CD47与SIRPα的结合,抑制性信号被解除,可以重新激活吞噬细胞功能,吞噬消除恶性或死亡细胞。既往研究已经初步证实,在多种肿瘤中,CD47靶点单克隆抗体或者SIRPα靶点单克隆抗体均可以发挥很好地抗肿瘤效应。众多研究发现CD47普遍高表达于各种恶性肿瘤细胞,但是很少有研究探究何种分子机制导致CD47异常高表达。本研究旨在探讨国产CD47靶点单克隆抗体体内外抗AML效应,并初步探讨导致CD47异常高表达的分子生物学机制,为改善AML治疗效果提供参考依据。研究方法:利用流式法检测21例临床确诊为AML患者和多种AML细胞系CD47表达水平。提取小鼠骨髓来源单核细胞和人外周血来源单核细胞经体外定向诱导分化为巨噬细胞。利用免疫荧光法和流式法检测国产CD47单抗增强巨噬细胞体外吞噬效应的现象,利用Annexin V/PI法检测国产CD47单抗对于AML细胞凋亡的影响,利用流式法检测国产CD47单抗对于AML细胞增殖的影响。选用NOG重度免疫缺陷小鼠作为荷瘤小鼠,指数期增长的U937经尾静脉注射构建AML模型,腹腔注射用药探究体内抗AML效应。通过Western blot和PCR方法,初步探究导致AML细胞高表达CD47的机制。研究结果:与正常骨髓细胞相比较,AML患者和细胞系普遍高表达CD47。本研究随机选取的21例患者中,所有患者的CD47表达量均高于正常对照组,其中17例CD47的表达量高于正常组的2倍。健康对照组MFI为628.3（范围为446-884）,AML组MFI为3430.6（范围为952-9310）。与IgG4相比,国产CD47单抗处理细胞后,0H、24H、48H和72H细胞增殖数并没有降低,Annexin V/PI法检测细胞凋亡率也并没有增多。流式法发现3种国产CD47单克隆抗体均可以很好地结合AML细胞,进一步研究发现国产CD47单克隆抗体可以竞争性拮抗原研CD47单克隆抗体的结合位点,为未来临床药物的推广应用提供了良好的理论基础。体外实验发现:对于高表达CD47的细胞系,国产CD47单抗可以增强巨噬细胞对此类细胞的吞噬清除,而对于低表达CD47的细胞系则无此效应。国产CD47单抗可以促进巨噬细胞对于原代AML细胞的吞噬消除。体内实验同样可以发现国产CD47单抗可以显着延长小鼠生存期。通过Western blot和PCR法,我们初步探讨了一下导致AML细胞表面高表达CD47的可能机制,令人欣喜的是,我们发现缺氧诱导因子1与CD47的过表达存在明显的相关性。研究结论:国产CD47靶点单克隆抗体可以通过阻断CD47/SIRPα信号通路重新激活巨噬细胞功能,增强巨噬细胞对AML细胞的吞噬清除。另外本研究初步发现缺氧诱导因子可以调控CD47的表达。
黄欣梅[6]（2018）在《鸡和缓艾美耳球虫微线蛋白在侵入部位特异性中的作用》文中指出鸡球虫在宿主体内寄生具有明显的部位特异性,柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella,E.tenella）寄生于盲肠;堆型艾美耳球虫（Eimeria acervuliina,E.acervuliina）和早熟艾美耳球虫（Eimeria praecox,E.praecox）主要寄生于十二指肠和小肠前段;巨型艾美耳球虫（Eimeria maxima,E.maxima）和毒害艾美耳球虫（Eimeria necatrix,E.necatrix）寄生于小肠中部;布氏艾美耳球虫（Eimeria brunetti,E.bruneti）与和缓艾美耳球虫（Eimeria mitis,E.mitis）寄生于小肠后段、直肠和盲肠近端区。目前的研究认为,球虫子孢子表面分子与鸡肠道上皮细胞形成配体-受体关系,从而介导侵入过程中的接触、识别等,进而决定宿主侵入和寄生部位特异性。但决定部位特异性的虫体配子和细胞表面受体尚不完全明了。本研究以寄生在小肠后段的和缓艾美耳球虫为研究对象,观察了和缓艾美耳球虫微线蛋白在侵入部位特异性中的作用。本研究对于阐明和缓艾美耳球虫寄生部位特异性的分子机制具有重要意义,也为和缓艾美耳球虫新型疫苗的研发提供多种候选抗原。1 和缓艾美耳球虫子孢子蛋白中与鸡小肠后段上皮细胞结合蛋白的鉴定提取了E.mitis子孢子可溶性蛋白,证实该子孢子蛋白可与鸡小肠后段上皮细胞结合。进一步用免疫共沉淀方法收集与鸡小肠后段上皮细胞结合的E.mitis子孢子蛋白,应用LC-MS/MS（nanoLC-QE）进行蛋白质谱鉴定,并对鉴定出的蛋白序列进行Gene ontology（GO）分析。分析结果表明,鉴定出的蛋白中有12个蛋白是与侵入相关的,包括微线蛋白、14-3-3蛋白、棒状体颈部蛋白、表面抗原、钙调蛋白等。共有91个蛋白被成功注释,其中有56个蛋白与结合活性有关（占总蛋白数61.54%）,22个蛋白具有催化活性（占总蛋白数24.18%）。这些蛋白有可能在E.mitis侵入宿主细胞过程中发挥作用。这些研究结果为进一步了解E.mitis在侵入宿主细胞过程中的相互作用机制提供了基础,也为更好地阐明E.mitis的致病机理提供了依据。2 和缓艾美耳球虫微线蛋白3（EmiMIC3）的分子鉴定及免疫保护性研究从E.mitis子孢子中克隆出微线蛋白3（E.mitis microneme protein 3,EmiMIC3）基因,并分析其序列特征。扩增出的EmiMIC3基因含有一个完整的开放阅读框,长3438 bp,编码1145个氨基酸,蛋白分子量约为124.9 kDa。序列分析表明EmiMIC3中含有9个微线黏附重复序列（MARs）。将扩增得到的EmiMIC3基因克隆至原核表达载体pET-32a（+）中,表达重组蛋白rEmiMIC3。Western blot分析结果表明,重组蛋白rEmiMIC3可被人工感染E.mitis的鸡血清识别,而E.mitis子孢子天然蛋白也可被抗rEmiMIC3大鼠血清所识别。免疫荧光染色试验结果显示E.mitis子孢子和裂殖子阶段均有表达EmiMIC3。以rEmiMIC3免疫鸡可引发高水平的特异性IgG抗体,促进IFN-γ、IL-10、IL-17和TGF-β分泌,提高CD4+和CD8+T淋巴细胞比例。免疫保护试验结果显示免疫rEmiMIC3可显着提高动物体重增长,降低卵囊排出量和平均病变记分。结果表明EmiMIC3可作为临床抗球虫的候选疫苗抗原。3 和缓艾美耳球虫微线蛋白2（EmiMIC2）的分子鉴定及免疫保护性研究从E.mitis子孢子中克隆出微线蛋白2（E.mitis microneme protein 2,EmiMIC2）基因,并分析其序列特征。扩增出的EmiMIC2基因含有一个完整的开放阅读框,长2175 bp,编码724个氨基酸,蛋白分子量约为75.8 kDa。序列分析表明EmiMIC2中含有1个vWFA superfamily结构域和4个TSP1结构域。将扩增得到的EmiMIC2基因克隆至原核表达载体pET-32a（+）中,表达重组蛋白rEmiMIC2。Western blot分析结果表明,重组蛋白rEmiMIC2可被人工感染E.mitis的鸡血清识别,而E.mtis子孢子天然蛋白也可被抗rEmiMIC2大鼠血清所识别。免疫荧光染色试验结果显示E.mitis子孢子和裂殖子阶段均有表达EmiMIC2。以rEmiMIC2免疫鸡可引发高水平的特异性IgG抗体,促进IL-2、IL-4、IL-10和TGF-β分泌,提高CD4+和CD8+T淋巴细胞比例。免疫保护试验结果显示免疫rEmiMIC2可显着提高动物体重增长,降低卵囊排出量和平均病变记分。4 和缓艾美耳球虫微线蛋白etmic-2/7h（EmiEtmic-2/7h）的分子鉴定及免疫保护性研究从E.mitis子孢子中克隆出微线蛋白etmic-2/7h（E.mitis Etmic-2/7h,EmiEtmic-2/7h）基因,并分析其序列特征。扩增出的EmiEtmic-2/7h基因含有一个完整的开放阅读框,长888 bp,编码295个氨基酸,蛋白分子量约为30.0 kDa。序列分析表明EmiEtmic-2/7h中含有1个Etmic-2 superfamily结构域。将扩增得到的EmiEtmic-2/7h基因克隆至原核表达载体pET-32a（+）中,表达重组蛋白rEmiEtmic-2/7h。Western blot分析结果表明,重组蛋白rEmiEtmic-2/7h可被人工感染E.mitis的鸡血清识别,而E.mitis子孢子天然蛋白也可被抗rEmiEtmic-2/7h大鼠血清所识别。免疫荧光染色试验结果显示E.mitis子孢子和裂殖子阶段均有表达EmiEtmic-2/7h。以rEmiEtmic-2/7h免疫鸡可引发高水平的特异性IgG抗体,促进IFN-γ、IL-2、IL-4和TGF-β表达,提高CD4+和CD8+T淋巴细胞比例。免疫保护试验结果显示免疫rEmiEtmic-2/7h可显着提高动物体重增长,降低卵囊排出量和平均病变记分。5和缓艾美耳球虫顶膜抗原1（EmiAMA1）的分子鉴定及免疫保护性研究从E.mitis子孢子中克隆出顶膜抗原1（E.mitis apical membrane antigen 1,EmiAMA1）基因,并分析其序列特征。扩增出的EmiAMA1基因含有一个完整的开放阅读框,长273 bp,编码90个氨基酸,蛋白分子量约为9.9 kDa。序列分析表明EmiAMA1中含有1个AMA-1 superfamily结构域。将扩增得到的EmiAMA1基因克隆至原核表达载体pET-32a（+）中,表达重组蛋白rEmiAMA1。Western blot分析结果表明,重组蛋白rEmiAMAl可被人工感染E.mitis的鸡血清识别。免疫荧光染色试验结果显示E.mitis子孢子和裂殖子阶段都有表达EmiAMA1。以rEmiAMA1免疫鸡可引发高水平的特异性 IgG 抗体,促进 IFN-y、IL-2、IL-4、IL-10、IL-17D 和 TGF-β 表达,提高 CD4+和CD8+T淋巴细胞比例。免疫保护试验结果显示免疫rEmiAMA1可显着提高动物体重增长,降低卵囊排出量和平均病变记分。6微线蛋白其结构域在E.mitis子孢子侵入过程中的作用微线蛋白在艾美耳球虫侵入宿主细胞的早期阶段发挥了重要作用。在前期的研究中我们发现EmiMIC3是由9个串联的微线蛋白黏附重复结构域（Microneme adhesive repeat,MAR）组成的。为探究EmiMIC3及其包含的EmiMARs在E.mitis子孢子侵入宿主细胞过程中的作用,我们分别克隆并表达了 EmiMIC3及EmiMARs蛋白。免疫荧光分析结果表明EmiMIC3可与鸡小肠后段上皮细胞结合。细胞ELISA分析结果表明EmiMARs均可以和鸡小肠后段上皮细胞结合,但其中EmiMAR4的结合能力是最强的。鸡不同部位肠道免疫组化分析结果表明,EmiMIC3可以特异性结合小肠后段,而不结合其他肠段。而EmiMIC2,EmiEtmic-2/7和EmiAMA1与所有的肠段都不结合。EmiMIC3中只有EmiMAR4可与小肠后段结合,而不与其他肠段结合。此外,体外、体内试验均表明抗EmiMIC3血清可显着抑制E,mitis子孢子侵入宿主细胞。因此,EmiMIC3及其所包含的EmiMARs在E.mitis子孢子侵入过程以及寄生部位特异性方面发挥重要的作用。
刘飞[7]（2017）在《allo-HSCT后急性移植物抗宿主病患者外周血树突状细胞TSP-1的表达变化及意义》文中提出目的:凝血酶敏感蛋白-1（TSP-1）是一种多功能细胞外基质糖蛋白,可在多种细胞中表达,在体内参与多种生理活动,其中包括抑制血管形成,参与细胞黏附、迁移,诱导细胞凋亡等。但在诱导免疫耐受及在移植物抗宿主病中的作用研究较少。我们通过测定恶性血液病患者在行异基因造血干细胞移植术后发生急性移植物抗宿主病时树突状细胞表面TSP-1的表达变化,探讨TSP-1与急性移植物抗宿主病的关系及意义。方法:以临床上行异基因造血干细胞移植患者为研究对象,随机抽取移植前患者、移植后未发生aGVHD患者、移植后刚发生aGVHD时但未进行aGVHD治疗时患者外周血,通过患者外周血分离单个核细胞,培养成熟树突状细胞,流式细胞仪检测其移植前、移植后无aGVHD、移植后发生aGVHD时树突状细胞表面TSP-1的表达情况并进行比较,查看其表达变化有无意义。结果:移植前组树突状细胞中TSP-1阳性细胞所占百分比为（47.92±9.24）%,移植后无aGVHD组为（49.10±10.79）%,移植后发生aGVHD组为（23.44±4.46）%。移植前组TSP-1阳性细胞所占百分比（47.92±9.24）%与移植后无aGVHD组TSP-1阳性细胞所占百分比（49.10±10.79）%组间比较,差异无统计学意义（P>0.05）,而移植后发生aGVHD组TSP-1阳性细胞所占百分比（23.44±4.46）%与移植前组（47.92±9.24）%组间相比,差异有统计学意义（P<0.05）,移植后发生aGVHD组TSP-1阳性细胞所占百分比（23.44±4.46）%与移植后无aGVHD组（49.10±10.79）%相比,差异亦有统计学意义（P<0.05）,移植后aGVHD组TSP-1的表达明显比移植前及移植后无aGVHD组降低。结论:aGVHD患者树突状细胞表面TSP-1的表达明显比移植前和移植后无aGVHD组降低,树突状细胞TSP-1的表达和aGVHD的发生具有一定的相关性。
陈芳[8]（2017）在《Rev-erbβ相互作用分子的验证及Rev-erbβ功能研究》文中指出Rev-erbβ是核受体Rev-erbs家族成员之一,在机体许多组织、细胞中均有表达,在骨骼肌、大脑、肾、肝脏和脂肪中表达水平较高。Rev-erbβ是机体重要的转录调节因子,广泛参与昼夜节律、代谢、炎症以及癌症等生理、病理过程。新近研究发现在一些肿瘤细胞中,Rev-erbβ的表达量明显增高于Rev-erbα。这些研究提示Rev-erbβ可能在肿瘤发生、发展过程中具有重要功能,但到目前为止,这方面的研究还相对较少以及分子调控机制仍还不清楚。PGRN是本实验室研究多年的一个具有多种功能的生长因子,它也广泛参与机体代谢、炎症和肿瘤等生理、病理过程。实验室前期在酵母双杂交筛库时筛选出Rev-erbβ与PGRN具有相互作用。因此,为了进一步验证Rev-erbβ和PGRN是否真正具有相互作用以及探索它们共同参与机体代谢、炎症及肿瘤等生理、病理过程的分子机理。本课题开展的研究内容如下:（1）Rev-erbβ单克隆抗体制备与鉴定:考虑到目前市场上针对人源Rev-erbβ的商业化抗体存在效价低,特异性差,且难以满足内源性Rev-erbβ的检测和免疫沉淀（IP）、染色质免疫沉淀（ChIP）等实验研究。本课题通过单克隆抗体的制备技术,成功制备出5株分别针对Rev-erbβ四个不同结构域的单克隆抗体（即抗体38E6针对Rev-erbβ-A/B结构域,抗体40H8/40D8针对Rev-erbβ-C结构域,抗体37H8针对Rev-erbβ-D结构域,抗体39C5针对Rev-erbβ-E结构域）。通过一系列分析和验证实验得知,所制备的5株单克隆抗体不仅可以特异识别Rev-erbp不同的结构域,而且这些抗体可用于识别或检测内源性Rev-erbβ蛋白质、Western blot、免疫荧光细胞染色、IP以及ChIP等实验研究。（2）Rev-erbβ与PGRN相互作用的验证:在实验室前期研究的基础上（用人源PGRN为诱饵蛋白初步筛选出的Rev-erbβ,可能是与PGRN发生相互作用的候选分子）。实验通过酵母双杂交技术、免疫共沉淀技术和GST-pulldown结合实验来进一步验证PGRN与Rev-erbβ存在有直接的相互作用。通过共聚焦显微镜研究PGRN与Rev-erbβ在CHO细胞中的共定位情况,结果表明Rev-erbβ可以介导PGRN由细胞质向细胞核的转移,并与PGRN在细胞质和细胞核内形成颗粒状的共定位分布。（3）PGRN介导Rev-erbβ对靶基因表达调控的分子机制研究:由于核受体Rev-erbβ是机体重要的转录因子,为了验证PGRN对Rev-erbβ转录作用的影响,本实验构建了 GAL4-BD-Rev-erbβ-E融合蛋白载体和GAL4-UAS-CMV-Luci荧光素酶报告基因检测系统。为了检测PGRN与Rev-erbβ相互作用对Rev-erbβ靶基因调控的影响,利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,构建了PGRN和Rev-erbβ双敲除的HEK293细胞系。将PGRN质粒与荧光素酶报告基因检测系统中的两个质粒GAL4-BD-Rev-erbβ-E 和 GAL4-UAS-CMV-Luci 共转染到 HEK293 细胞中,发现PGRN可以增强GAL4-BD-Rev-erbβ-E对GAL4-UAS-CMV启动子的抑制作用。在PGRN和Rev-erbβ双敲除的HEK293细胞系中,发现PGRN可以增强Rev-erbβ对外源靶基因启动子（hBmal1/hApoCⅢ/Srebp-1cpromoter）活性的转录调节作用,同时还证实PGRN和Rev-erbβ结合可以导致细胞中内源Rev-erbβ靶基因Bmal1 mRNA表达水平显着下降。（4）在肝癌HepG2细胞中初步研究Rev-erbβ的生物学功能:考虑到Rev-erbβ相互作用分子PGRN在肿瘤组织、细胞呈现高表达,并具有促进肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭等生物学功能。本研究以Rev-erbβ基因敲除HepG2和慢病毒感染过表达Rev-erbβ基因的HepG2细胞系为模型,初步研究了 Rev-erbβ对肿瘤发生、发展的影响。综上所述,本课题研究获得了以下结果:（1）成功制备了 5株针对Rev-erbβ不同结构域的单克隆抗体。（2）通过酵母双杂交技术、免疫共沉淀技术和GST-pull down等实验手段证实Rev-erbβ与PGRN两者存在有直接的相互作用,并确定了Rev-erbβ和PGRN相互作用的结合部位分别是PGRN的BAC区域和Rev-erbβ-E结构域。（3）PGRN对Rev-erbβ靶基因转录调控影响研究结果表明,PGRN与Rev-erbβ结合,可以协同Rev-erbβ对靶基因转录进行转录调控作用。（4）Rev-erbβ生物学功能研究结果表明,在HepG2细胞中Rev-erbβ不仅具有抑制脂肪形成的作用;而且还可抑制HepG2细胞增殖、迁移及侵袭等肿瘤发生、发展过程。总之,以上这些研究结果为探讨Rev-erbβ与PGRN在肿瘤细胞中可能存在共同调节的分子机制和信号通路提供坚实的研究基础。
方霁[9]（2016）在《基于多组学的补肾活血方防治绝经后骨质疏松症机制研究》文中指出目的:通过代谢组、蛋白组和转录组学方法初步研究补肾活血方（Tonifying Kidney and Activating Blood Formulas,TKABF）防治绝经后骨质疏松（Postmenopausal osteoporosis,PMOP）症的可能分子机制。方法:1.全骨髓贴壁法获取正常rBMSCs（Normal Bone Mesenchymal stem cells,NBM）和OP状态下rBMSCs（Osteoporotic bone Mesenchymal stem cells,OBM）并鉴定;采用双侧去卵巢法复制OP大鼠模型,双能X线法检测TKABF对去卵巢OP大鼠BMD的影响;ALP法检测cs TKABF促rBMSCs分泌ALP活性;2.3月龄SD雌性大鼠随机分为空白（Control）（n=6）与TKABF（n=6）组,TKABF组予以复方灌胃1.5m L,即1.035g/kg·d（人-大鼠体表面积换算大鼠等效量）,相当于成人临床给药量（11.5g/d）,Control组予以等体积（1.5m L）蒸馏水,灌胃12d,取血浆采用LC-MS对血浆代谢物进行分析;3.3月龄SD雌性大鼠随机分为空白（Control）（n=5）与TKABF（n=5）组,TKABF组予以复方灌胃1.5m L,即1.035g/kg·d（人-大鼠体表面积换算大鼠等效量）,相当于成人临床给药量（11.5g/d）,Control组予以等体积（1.5m L）蒸馏水,灌胃12d,取血清制备cs TKABF。i TRAQ法对NBM及cs TKABF+NBM（cs TKABF浓度为15%,干预24h）进行蛋白质高通量检测;4.3月龄SD雌性大鼠随机分为Sham（n=10）与OVX组（n=15）,OVX组行去双侧卵巢术,Sham组行假手术。去卵巢12w评价模型复制成功,将OVX组随机分为OVX（n=9）与OVX+TKABF（n=6）组,OVX+TKABF予以复方灌胃3m L（去卵巢OP大鼠模型复制成功,给药时大鼠平均体重约为400g,因此,经换算给药量为3m L）,即1.035g/kg·d（人-大鼠体表面积换算大鼠等效量）,相当于成人临床给药量（11.5g/d）,Sham与OVX组均予以等体积（3m L）蒸馏水。干预12w,取血清,采用i TRAQ法对血清蛋白进行高通量检测;5.3月龄SD雌性大鼠随机分为空白（Control）（n=5）与TKABF（n=5）组,TKABF组予以复方灌胃1.5m L,即1.035g/kg·d（人-大鼠体表面积换算大鼠等效量）,相当于成人临床给药量（11.5g/d）,Control组予以等体积（1.5m L）蒸馏水,灌胃12d,取血清制备cs TKABF。采用illumina Hiseq4000测序仪对NBM、OBM及cs TKABF+OBM（cs TKABF浓度为15%,干预24h）3组mRNA进行高通量测序。结果:1.P3代NBM与OBM组细胞CD29（99.93%与95.79%）、CD90（99.70%与99.55%）均呈阳性表达,而CD45（1.70%与1.46%）、CD80（4.45%与0.69%）均呈阴性表达;G0/G1所占比例分别为:87%与85.4%;生长曲线均呈S型;Gomori钙钴法ALP、茜素红、油红O以及甲苯胺蓝染色均呈阳性;与Sham组比较,OVX组大鼠右股骨、右肱骨、左股骨近端和远端以及L4-5等部位BMD显着降低（P≤0.01）,TKABF干预12w,与OVX组比较,OVX+TKABF组右股骨、右肱骨、左股骨近端及远端BMD显着高于OVX组（P≤0.01）;与Control组比较,cs TKABF+NBM与cs TKABF+OBM分泌ALP活性均显着增高（P≤0.01）;2.TKABF较Control组可显着上调10个和下调35个血浆代谢物成分（P<0.05）,涉及22条代谢通路;3.cs TKABF较NBM组可显着上调17个和下调包括锌指结构相关蛋白Zfyve16（R=0.75,P=0.008）和ZIP1（R=0.70,P=0.001）在内的26个蛋白质（P<0.05）,涉及22条细胞信号通路;4.OVX较Sham组差异有统计学意义（P<0.05）,并且OVX+TKABF较OVX组差异也有显着性（P<0.05）,而与Sham组比较,差异无显着性（P≥0.05）的蛋白有17个,已知功能蛋白为9个,分别为（OVX+TKABF vs OVX）（P<0.05;R为变化倍数,R>1为上调,R<1为下调）:LIFR（R=2.32,P=0.000）、CEH（R=1.92,P=0.003）和FGL2（R=0.47,P=0.012）、TSP-1（R=0.39,P=0.001）、CXCC/RTCK1（R=0.32,P=0.000）、PPlase（R=0.32,P=0.000）、PF4（R=0.29,P=0.000）、KIF（R=0.26,P=0.000）、CCDC60（R=0.24,P=0.000）,未知功能蛋白有8个;5.OBM较NBM组有显着性差异（P<0.05）,并且Cs TKABF+OBM较OBM组差异也有显着性（P<0.05）,而较NBM组差异无显着性（P≥0.05）的mRNA有21个,已知功能基因为13个,分别为OVX+TKABF vs OVX:（Fold Change,FC值为调节倍数,“+”为上调、“-”为下调;P<0.05）,):Brd1（FC=4.934,P=7.71E-31）、Zfp219（FC=2.649,P=6.72E-8）、Ahdc1（FC=2.020,P=3.68E-05）、Adra2a（FC=2.001,P=4.30E-5）、Uspl1（FC=1.882,P=0.000106）、Gatad2b（FC=1.572,P=0.001258）、Rfc1（FC=1.564,P=0.001069）、Hspb6（FC=1.38,P=0.00035）和Gcc2（FC=-3.056,P=2.92E-10）、Egr2（FC=-3.055,P=2.91E-13）、Col7a1（FC=-2.331,P=2.49E-06）、Jun（FC=-1.672,P=4.57E-75）、Hs6st2（FC=-1.618,P=0.000699）,未知功能基因为8个。Cs TKABF+OBM较OBM组,差异具有显着性（P<0.05）,并编码锌指结构域及其相关基因的直系同源物有:5个含KRAB锌指结构域基因、1个含CXXC锌指结构域基因、1个BTB锌指结构域基因、2个SLC39A81、1个SLC39A1以及Zn元素相关基因:1个MED15、1个KLF2以及1个TRAF3。结论:1.TKABF调控正常rBMSCs鞘脂信号通路可能与上调正常大鼠血浆代谢物二氢神经鞘氨醇有关;TKABF调控正常rBMSCs的磷脂酶D（Phospholipase D,PLD）信号可能与大量下调正常大鼠血浆Lyso PC与Lyso PE类代谢物有关;TKABF可下调正常大鼠血浆组氨酸（Histidine,His）水平;2.含卷曲结构域蛋白CCDC60上调可能为肾虚型OP模型的一个潜在靶标,TKABF可通过下调其表达水平改善去卵巢OP大鼠BMD;含GRIP和卷曲螺旋结构域Gcc2 mRNA表达水平上调可能为去卵巢对rBMSCs的影响特征之一,cs TKABF可通过下调其水平而促OP状态下rBMSCs骨向分化;含卷曲结构域蛋白可能为TKABF防治PMOP的一个重要靶点;3.cs TKABF可通过下调含FYVE锌指结构域蛋白Zfyve16和由SLC30A1基因编码的锌转运蛋白ZIP1促正常rBMSCs骨向分化;4.编码C2H2型锌指结构域基因Zfp219和GATA型锌指结构基因Gatad2b mRNA的表达水平下调可能为去卵巢对rBMSCs的影响特征之一,而cs TKABF可通过上调其表达水平而促OP状态下rBMSCs骨向分化;编码C2H2型锌指结构域基因Egr2 mRNA的表达上调可能为去卵巢对rBMSCs影响的又一特征,而cs TKABF可通过下调其表达水平而促OP状态下rBMSCs骨向分化;5.cs TKABF可通过调控5个含KRAB锌指结构域、1个含CXXC锌指结构域、1个BTB锌指结构域、2个SLC39A81、1个SLC39A1以及与Zn元素相关1个MED15、1个KLF2以及1个TRAF3基因直系同源物而促OP状态下rBMSCs骨向分化;含锌指结构域蛋白可能为TKABF防治PMOP的又一个重要靶点;6.TKABF可通过特异性调控多种锌指结构域亚型防治PMOP,可能与下调血浆His水平有关;这种特异性结合锌指结构域可能也与上调血浆二氢神经鞘氨醇参与的rBMSCs内鞘脂信号通路有关。其机制可能为TKABF由大量含Zn量丰富的补肾药组成;综上,TKABF可通过特异性调控含卷曲结构域和多种锌指结构域亚型蛋白或基因防治PMOP。
刘芳[10]（2016）在《C1ql1和C1ql4促进新生血管形成的机制研究》文中认为本实验室前期发现重组制备的融合表达的C1ql1和C1ql4球状结构域蛋白（g C1ql1和g C1ql4）能够促进大鼠心脏微血管内皮细胞的管状结构形成及细胞迁移,且在此过程中ERK1/2的磷酸化被激活。为了进一步明确g C1ql1和g C1ql4促进血管新生的作用及调控机制,人脐带静脉内皮细胞和鸡胚卵黄囊膜模型被用为两种新的血管新生模型探索g C1ql1和g C1ql4对血管新生的作用;ERK1/2信号通路上游分子MEK抑制剂U0126也用于探索ERK1/2信号通路对g C1ql1和g C1ql4促进的血管新生调控;基于基因表达谱芯片和Realtime PCR技术对g C1ql1和g C1ql4蛋白促进心脏微血管内皮细胞血管新生的下游效应基因进行了分析。缺氧是一种常见的导致血管内皮损伤的病理因素,可通过损伤内皮结构和功能引发多种心血管疾病。积极改善缺氧损伤导致的血管内皮功能受损对防止心血管疾病具有重要意义。在本研究中我们也采用流式细胞术结合CCK8细胞活性对g C1ql1对心脏微血管内皮损伤作用进行了初步探讨。通过细胞划痕实验和Matrigel成管实验发现,重组制备的C1ql1和C1ql4球状结构域蛋白以剂量及时间依赖效应促进人脐带静脉内皮细胞的管状结构形成及迁移,对鸡胚卵黄囊膜血管的新生具有促进影响。Western blot显示人脐带静脉内皮细胞和心脏微血管内皮细胞经g C1ql1和g C1ql4处理后ERK1/2磷酸化被激活,U0126可以抑制g C1ql1和g C1ql4诱导的人脐带静脉内皮细胞和心脏微血管内皮细胞迁移及管状形成。利用基因表达谱芯片和实时定量PCR技术分析发现心脏微血管内皮细胞经g C1ql1和g C1ql4处理后,促血管新生相关因子VEGF、GDF15、PGDF、NOS2、CYP7B1及ENGL3等基因均有不同程度表达上调。使用流式细胞术分析发现预处理g C1ql1蛋白能够缓解由缺氧诱导的CMEC细胞凋亡;CCK8细胞活性测定进一步发现经g C1ql1预处理后,缺氧导致的CMECs细胞活性降低得到了抑制,暗示g C1ql1蛋白对心脏微血管内皮损伤具有一定的保护作用。
二、Expression, purification of a synthetic fuse-protein-TSF from PF4 and TSP1 fragments and its effect on angio-genesis and tumor growth（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Expression, purification of a synthetic fuse-protein-TSF from PF4 and TSP1 fragments and its effect on angio-genesis and tumor growth（论文提纲范文）
（1）EFEMP1与IZUMO1的相互作用及对受精的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略说明 |
| 第一章 EFEMP1 的研究进展 |
| 1 Fibulin家族概述 |
| 2 Fibulin家族成员概述 |
| 2.1 长Fibulin亚类 |
| 2.1.1 Fibulin-1 |
| 2.1.2 Fibulin-2 |
| 2.1.3 Fibulin-6和Fibulin-8 |
| 2.2 短Fibulin亚类 |
| 2.2.1 Fibulin-3 |
| 2.2.2 Fibulin-4 |
| 2.2.3 Fibulin-5 |
| 2.2.4 Fibulin-7 |
| 3 EFEMP1 的基本特性 |
| 3.1 EFEMP1 的结构特征 |
| 3.2 EFEMP1 的表达模式 |
| 3.3 EFEMP1 参与的蛋白质相互作用 |
| 3.3.1 EFEMP1与PDIA3 的相互作用 |
| 3.3.2 EFEMP1与TIMP-3 的相互作用 |
| 3.3.3 EFEMP1与DA41 的相互作用 |
| 3.3.4 EFEMP1 与原弹性蛋白的相互作用 |
| 3.3.5 EFEMP1与ECM1 的相互作用 |
| 3.4 efemp1 基因敲除小鼠模型 |
| 3.4.1 efemp1 基因敲除小鼠的筋膜组织异常 |
| 3.4.2 efemp1 基因敲除小鼠的角膜和Bruch膜异常 |
| 3.4.3 efemp1 基因敲除小鼠嗅觉传导通路的修复功能异常 |
| 3.5 EFEMP1 相关的人类疾病 |
| 3.5.1 腹股沟疝 |
| 3.5.2 Doyne蜂窝状视网膜营养不良 |
| 3.5.3 癌症 |
| 3.6 EFEMP1 在生殖中的作用 |
| 第二章 EFEMP1与IZUMO1 的相互作用及对受精的影响 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验菌种与细胞 |
| 2.1.3 质粒载体 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 实验试剂 |
| 2.1.6 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大鼠睾丸总RNA的提取 |
| 2.2.2 大鼠睾丸组织cDNA的合成 |
| 2.2.3 大鼠睾丸组织cDNA的检测 |
| 2.2.4 大鼠efemp1 CDS全长的克隆 |
| 2.2.4.1 克隆引物的设计和合成 |
| 2.2.4.2 efemp1 CDS全长克隆 |
| 2.2.4.3 efemp1-T重组载体的构建与鉴定 |
| 2.2.4.4 重组质粒测序结果分析 |
| 2.2.5 酵母双杂实验 |
| 2.2.5.1 efemp1 酵母重组载体亚克隆引物的设计与合成 |
| 2.2.5.2 大鼠efemp1 目的片段的扩增与过渡载体的构建 |
| 2.2.5.3 pGAD-efemp1 重组载体的构建与鉴定 |
| 2.2.5.4 醋酸锂法制备酵母感受态细胞 |
| 2.2.5.5 重组载体转化酵母感受态细胞 |
| 2.2.5.6 酵母双杂交 |
| 2.2.6 免疫共沉淀实验 |
| 2.2.6.1 efemp1 真核重组载体亚克隆引物的设计与合成 |
| 2.2.6.2 pCMV-Flag-efemp1 重组载体的构建与鉴定 |
| 2.2.6.3 293 T细胞的培养 |
| 2.2.6.4 细胞共转染 |
| 2.2.6.5 磁珠法免疫沉淀转染细胞总蛋白 |
| 2.2.7 大鼠EFEMP1 的原核表达纯化及多克隆抗体制备 |
| 2.2.7.1 efemp1 原核重组载体亚克隆引物的设计与合成 |
| 2.2.7.2 pET-28a-efemp1 原核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.2.7.3 EFEMP1-HIS融合蛋白的诱导表达 |
| 2.2.7.4 EFEMP1-HIS融合蛋白的SDS-PAGE检测 |
| 2.2.7.5 EFEMP1-HIS融合蛋白的Western blot检测 |
| 2.2.7.6 EFEMP1-HIS融合蛋白的纯化与检测 |
| 2.2.7.7 Bradford法测定纯化后EFEMP1-HIS融合蛋白的浓度 |
| 2.2.7.8 EFEMP1 抗体的制备与检测 |
| 2.2.7.9 大鼠和小鼠肺组织总蛋白对自制多克隆抗体的特异性检测 |
| 2.2.8 间接免疫荧光技术检测EFEMP1 的定位及与IZUMO1 的共定位 |
| 2.2.8.1 EFEMP1 在小鼠睾丸和卵巢中的定位 |
| 2.2.8.2 EFEMP1 在顶体反应前后大鼠精子和小鼠精子中的定位 |
| 2.2.8.3 EFEMP1和IZUMO1 在顶体反应前后大鼠精子和小鼠精子中的共定位 |
| 2.2.8.4 EFEMP1 在小鼠MII期卵母细胞中的定位 |
| 2.2.9 EFEMP1 抗体处理后小鼠精卵的体外授精观察 |
| 3 结果 |
| 3.1 大鼠efemp1的CDS序列克隆 |
| 3.1.1 大鼠睾丸组织cDNA合成产物的检测 |
| 3.1.2 大鼠efemp1 cDNA序列的克隆 |
| 3.1.3 重组载体efemp1-T的双酶切鉴定 |
| 3.2 酵母双杂交实验 |
| 3.2.1 pGAD-efemp1 重组载体的构建与鉴定 |
| 3.2.2 pGAD-efemp1 重组载体转化酵母感受态细胞的菌落PCR鉴定 |
| 3.2.3 酵母双杂交 |
| 3.2.4 营养缺陷培养基上双杂交酵母的生长状况 |
| 3.3 免疫共沉淀鉴定EFEMP1与IZUMO1 的相互作用 |
| 3.3.1 pCMV-Flag-efemp1 重组载体的构建与鉴定 |
| 3.3.2 转染后293 T细胞总蛋白的Western blot检测 |
| 3.3.3 磁珠法免疫沉淀转染细胞总蛋白 |
| 3.4 大鼠EFEMP1 的原核表达纯化及多克隆抗体制备 |
| 3.4.1 pET-28a-efemp1 重组载体的构建与鉴定 |
| 3.4.2 EFEMP1-HIS融合蛋白的诱导表达与鉴定 |
| 3.4.3 EFEMP1-HIS融合蛋白的纯化与检测 |
| 3.4.4 Bradford法测定纯化后EFEMP1-HIS融合蛋白的浓度 |
| 3.4.5 EFEMP1 抗体的制备与检测 |
| 3.4.6 大鼠和小鼠肺组织总蛋白对自制多克隆抗体的特异性检测 |
| 3.5 间接免疫荧光技术检测EFEMP1 的定位及与IZUMO1 的共定位 |
| 3.5.1 EFEMP1 在小鼠睾丸和卵巢中的定位 |
| 3.5.2 EFEMP1 在顶体反应前后大鼠和小鼠精子中的定位 |
| 3.5.3 EFEMP1和IZUMO1 在顶体反应前后大鼠和小鼠精子中的共定位 |
| 3.5.4 EEFMP1 在小鼠MII期卵母细胞中的定位 |
| 3.6 EFEMP1 抗体处理后小鼠精卵的体外授精观察 |
| 4 讨论 |
| 4.1 EFEMP1与IZUMO1 的相互作用 |
| 4.2 EFEMP1 在生殖细胞的定位及其与IZUMO1 的共定位 |
| 4.3 EFEMP1 对受精的影响 |
| 5 小结和创新点 |
| 5.1 小结 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间参与的科研项目和发表的论文 |
（2）凝血酶敏感蛋白-1与血管新生（论文提纲范文）
| 1 TSP-1的结构特征 |
| 2 TSP-1结构域受体及其功能 |
| 2.1 N结构域受体及功能 |
| 2.2 前胶原蛋白同源区P结构域受体及功能 |
| 2.3 C端结构域（G结构域）受体及功能 |
| 2.4 TSR1s受体及功能 |
| 2.5 TSR2s受体及功能 |
| 2.6 TSR3s受体及功能 |
| 3 TSP-1涉及的信号通路 |
| 4 TSP-1与血管新生 |
| 4.1 TSP-1与生长因子的关系 |
| 4.2 TSP-1与血管内皮细胞表面黏附分子的相互作用 |
| 4.3 来源于TSP的多肽片段抗血管新生及抗肿瘤研究进展 |
| 5 结语 |
（3）细粒棘球绦虫TSP8、TSP11基因的原核表达及免疫学初步分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 细粒棘球蚴病概述 |
| 1.1 病原 |
| 1.2 诊断方法 |
| 2 细粒棘球蚴病疫苗研制研究进展 |
| 2.1 细粒棘球绦虫中间宿主疫苗研究进展 |
| 2.2 细粒棘球绦虫终末宿主疫苗研究进展 |
| 3 四跨膜蛋白的研究进展 |
| 3.1 四跨膜蛋白的功能 |
| 3.2 寄生虫四跨膜蛋白研究进展 |
| 4 细粒棘球绦虫免疫学概述 |
| 4.1 细粒棘球绦虫的免疫逃避机制 |
| 4.2 包虫病中不同Th类型细胞因子的作用 |
| 5 展望 |
| 6 结语 |
| 第二章 试验内容 |
| 试验一 细粒棘球绦虫TSP8、TSP11 基因的克隆及序列测序 |
| 1.材料 |
| 1.1 虫株、质粒和菌株 |
| 1.2 主要试剂及材料 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2.试验方法 |
| 2.1 引物设计及合成 |
| 2.2 原头蚴总RNA的提取 |
| 2.3 反转录及目的基因的PCR扩增 |
| 2.4 RCR产物的回收、克隆以及测序 |
| 2.5 TSP基因的生物信息学分析 |
| 3.试验结果 |
| 3.1 总RNA质量检测 |
| 3.2 TSP基因的克隆 |
| 3.3 生物信息学分析 |
| 4.讨论 |
| 试验二 细粒棘球绦虫TSP8、TSP11 基因的原核表达 |
| 1.材料 |
| 1.1 质粒和菌株、血清 |
| 1.2 主要试剂及材料 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2.试验方法 |
| 2.1 引物设计及合成 |
| 2.2 目的基因的PCR扩增 |
| 2.3 RCR产物的回收、克隆以及测序 |
| 2.4 重组表达载体的构建 |
| 2.5 重组蛋白的表达 |
| 2.6 重组蛋白的可溶性分析 |
| 2.7 SDS-PAGE电泳检测 |
| 2.8 重组蛋白的纯化 |
| 2.9 鼠抗rEg-TSP-IgG的制备 |
| 2.10 免疫印迹分析 |
| 2.11 免疫荧光鉴定 |
| 3.试验结果 |
| 3.1 TSP基因主要抗原区域的扩增 |
| 3.2 重组p ET32a-TSP质粒的鉴定 |
| 3.3 重组蛋白的表达与抗原性分析 |
| 4.讨论 |
| 试验三 重组蛋白免疫学初步分析 |
| 1.材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂及材料 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2.方法 |
| 2.1 制备特异性抗血清 |
| 2.2 重组蛋白免疫学初步分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 qPCR法检测TSP免疫小鼠体内细胞因子变化 |
| 3.2 ELISA法检测TSP免疫小鼠体内抗体水平变化 |
| 4.讨论 |
| 第三章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（4）天然产物flavaglines对红白血病的抑制作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 主要缩略词 |
| 1 引言 |
| 1.1 问题的提出及研究意义 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 天然产物在肿瘤治疗上的地位 |
| 1.2.2 Flavagline类化合物研究概况 |
| 1.2.3 Fli-1 的研究进展 |
| 1.3 研究目的 |
| 1.4 研究内容 |
| 1.5 本论文的特色与创新之处 |
| 1.6 本论文解决的关键问题 |
| 2 筛选出抑制多种肿瘤细胞活性的flavagline类化合物 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料、试剂与仪器 |
| 2.2.1 实验材料与试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 主要试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 萤光素酶筛选检测 |
| 2.3.3 蛋白免疫印迹 |
| 2.3.4 PCR |
| 2.3.5 实时荧光定量PCR |
| 2.3.6 细胞活性测定 |
| 2.3.7 PI法测定细胞周期 |
| 2.3.8 红白血病小鼠体内实验 |
| 2.3.9 数据统计分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 Fli-1 在多种血液肿瘤细胞中的表达 |
| 2.4.2 Flavagline类化合物对Fli-1 反式激活作用的影响 |
| 2.4.3 Flavagline类化合物对Fli-1 表达的影响 |
| 2.4.4 Flavagline类化合物对多种血液肿瘤细胞活性的影响 |
| 2.4.5 Flavagline类化合物抑制红白血病细胞的增殖 |
| 2.4.6 Flavagline类化合物对红白血病细胞细胞周期的影响 |
| 2.4.7 Flavagline类化合物在红白血病小鼠上的治疗效果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 3 Flavagline类化合物诱导红白血病细胞凋亡及其促凋亡途径 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料、试剂与仪器 |
| 3.2.1 实验材料与试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 FITC Annexin V/PI法测定细胞凋亡 |
| 3.3.2 线粒体膜电位检测 |
| 3.3.3 蛋白免疫印迹 |
| 3.3.4 数据统计分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 Flavagline类化合物诱导红白血病细胞的凋亡 |
| 3.4.2 Flavagline类化合物对线粒体凋亡路径的影响 |
| 3.4.3 Flavagline类化合物对死亡受体凋亡路径的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 4 Flavagline类化合物对红白血病细胞分化的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料、试剂与仪器 |
| 4.2.1 实验材料与试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 流式细胞技术分析红白血病细胞分化 |
| 4.3.2 流式细胞技术分析小鼠脾细胞分化 |
| 4.3.3 PCR |
| 4.3.4 实时荧光定量PCR |
| 4.3.5 数据统计分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 Flavagline类化合物增加了红白血病细胞红系分化标志的表达 |
| 4.4.2 Flavagline类化合物增加了红白血病小鼠脾细胞红系分化标志的表达 |
| 4.4.3 Flavagline类化合物对细胞分化相关基因表达的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 5 Flavagline类化合物失活ERK-eIF4E通路 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料、试剂与仪器 |
| 5.2.1 实验材料与试剂 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 蛋白免疫印迹 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 Flavagline类化合物作用于ERK-eIF4E通路 |
| 5.4.2 Flavagline类化合物对eIF4E活性的影响 |
| 5.4.3 Flavagline类化合物下调survivin的表达 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 6 Fli-1 参与红白血病细胞的增殖 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料、试剂与仪器 |
| 6.2.1 实验材料与试剂 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 构建稳定沉默Fli-1 的细胞株 |
| 6.3.2 蛋白免疫印迹 |
| 6.3.3 实时荧光定量PCR |
| 6.3.4 稳定沉默Fli-1 细胞株细胞凋亡的测定 |
| 6.3.5 数据统计分析 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 Fli-1 敲减抑制红白血病细胞的增殖 |
| 6.4.2 Fli-1 对红白血病细胞凋亡的影响 |
| 6.4.3 Fli-1 下调减弱flavagline类化合物的红白血病细胞增殖抑制作用 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 本章小结 |
| 7 Flavagline类化合物下调Fli-1 表达的作用途径 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 实验材料、试剂与仪器 |
| 7.2.1 实验材料与试剂 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.3.1 蛋白免疫印迹 |
| 7.3.2 miRNA的实时荧光定量PCR分析 |
| 7.3.3 数据统计分析 |
| 7.4 结果与分析 |
| 7.4.1 MiR-145在flavagline类化合物抑制Fli-1 表达中的作用 |
| 7.4.2 蛋白合成途径在flavagline类化合物抑制Fli-1 表达中的作用 |
| 7.4.3 蛋白酶体途径在flavagline类化合物抑制Fli-1 表达中的作用 |
| 7.5 讨论 |
| 7.6 本章小结 |
| 8 结论与展望 |
| 8.1 主要结论 |
| 8.2 工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A.作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
| B.作者在攻读学位期间参与的科研项目 |
| C.学位论文数据集 |
| 致谢 |
（5）新型全人源化CD47单抗抗白血病效应及调控CD47表达的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、新型全人源化CD47单克隆抗体阻断CD47-SIRPα信号通路,促进巨噬细胞吞噬AML细胞 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 AML细胞系 |
| 1.1.2 病例对象 |
| 1.1.3 实验小鼠 |
| 1.1.4 巨噬细胞原代细胞来源 |
| 1.1.5 主要实验试剂 |
| 1.1.6 主要实验仪器 |
| 1.1.7 主要实验试剂配制 |
| 1.1.8 细胞培养和冻存方法 |
| 1.1.9 原代巨噬细胞提取和培养 |
| 1.1.10 巨噬细胞吞噬AML的体外实验 |
| 1.1.11 Western Blot(蛋白质印记) |
| 1.1.12 Trizol法提取细胞RNA |
| 1.1.13 RNA逆转录为c DNA |
| 1.1.14 qRT-PCR检测mRNA表达水平 |
| 1.1.15 免疫组化 |
| 1.1.16 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 AML患者白血病细胞上CD47的表达 |
| 1.2.2 AML细胞系上CD47的表达 |
| 1.2.3 CD47表达水平对AML患者预后的影响 |
| 1.2.4 国产新型全人源化CD47单克隆抗体对AML细胞增殖和凋亡的影响 |
| 1.2.5 国产新型全人源化CD47单克隆抗体抗原结合位点 |
| 1.2.6 国产新型全人源化CD47单克隆抗体体外抗AML效应 |
| 1.2.7 AML小鼠模型的构建 |
| 1.2.8 国产新型全人源化CD47单克隆抗体体内抗AML效应 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、AML中调控CD47异常表达的分子机制 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验对象和材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 乏氧诱导CD47mRNA水平高表达 |
| 2.2.2 乏氧诱导HIF-1α和CD47蛋白质水平高表达 |
| 2.2.3 课题延伸 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 一种新的固有免疫检查点-CD47在肿瘤中的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）鸡和缓艾美耳球虫微线蛋白在侵入部位特异性中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 鸡球虫病及其免疫防控的研究进展 |
| 1 鸡球虫的种类及其生活史 |
| 2 鸡球虫的侵入机理及其寄生部位特异性 |
| 3 鸡球虫的免疫机制 |
| 3.1 巨噬细胞在鸡球虫非特异性细胞免疫反应中的作用 |
| 3.2 T细胞在鸡球虫特异性细胞免疫反应中的作用 |
| 3.3 细胞因子在鸡球虫免疫中的作用 |
| 4 鸡球虫病的免疫防控 |
| 4.1 强毒活疫苗 |
| 4.2 弱毒活疫苗 |
| 4.3 亚单位疫苗 |
| 4.4 DNA疫苗 |
| 5 和缓艾美耳球虫的研究进展 |
| 5.1 病原体 |
| 5.2 最短孢子化时间和最小潜在期 |
| 5.3 寄生部位 |
| 5.4 发育史 |
| 5.5 流行情况 |
| 5.6 致病性 |
| 参考文献 |
| 第二章 微线蛋白在宿主特异性和组织嗜性中的作用 |
| 1 顶复门寄生虫 |
| 2 顶复门寄生虫侵入宿主细胞的机制 |
| 3 微线蛋白(MICs) |
| 3.1 1型凝血酶致敏蛋白-1结构域(Thrombospondin-1 type 1 domains,TSR) |
| 3.2 Von Willbrand A结构域/integrin inserted(Ⅰ)结构域 |
| 3.3 Apple/PAN结构域 |
| 3.4 EGF-样结构域 |
| 3.5 凝集素(Lectin)结构域 |
| 4 MICs识别宿主细胞表面糖类分子 |
| 4.1 含MAR结构域的蛋白(MCPs)结合唾液酸 |
| 4.2 含Apple结构域的MICs结合半乳糖 |
| 4.3 其他宿主黏附性MICs |
| 5 宿主和组织嗜性差异的分子基础 |
| 6 总结 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第三章 和缓艾美耳球虫子孢子蛋白中与鸡小肠后段上皮细胞结合蛋白的鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 E.mitis子孢子的纯化 |
| 2.2 E.mitis子孢子可溶性蛋白及其多克隆抗体的制备 |
| 2.3 鸡小肠后段肠上皮细胞的分离 |
| 2.4 免疫荧光检测子孢子可溶性蛋白与鸡小肠后段上皮细胞的结合 |
| 2.5 Western blot分析E.mitis子孢子可溶性蛋白与鸡小肠后段上皮细胞的结合 |
| 2.6 QE鉴定分析与鸡小肠后段上皮细胞结合的E.mitis子孢子可溶性蛋白 |
| 2.7 生物信息学分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 EmiMIC3的分子鉴定及免疫保护性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 EmiMIC3基因的扩增和序列分析 |
| 2.2 EmiMIC3序列同源性分析 |
| 2.3 重组表达质粒pET-32a-EmiMIC3的构建和鉴定 |
| 2.4 EmiMIC3重组蛋白的表达及纯化 |
| 2.5 大鼠抗rEmiMIC3抗体效价的检测 |
| 2.6 免疫印迹分析重组和天然蛋白EmiMIC3 |
| 2.7 E.mitis子孢子和裂殖子的纯化 |
| 2.8 免疫荧光检测EmiMIC3在子孢子和裂殖子时期的表达 |
| 2.9 重组蛋白rEmiMIC3抗E.mitis的免疫保护性 |
| 2.10 免疫rEmiMIC3后鸡血清中IgG水平检测 |
| 2.11 免疫rEmiMIC3后鸡血清中细胞因子水平检测 |
| 2.12 脾淋巴细胞中细胞因子转录水平的检测 |
| 2.13 免疫rEmiMIC3后鸡脾淋巴细胞中CD4~+和CD8~+T细胞的变化 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 EmiMIC2的分子鉴定及免疫保护性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 EmiMIC2基因的扩增和序列分析 |
| 2.2 EmiMIC2序列同源性分析 |
| 2.3 重组表达质粒pET-32a-EmiMIC2的构建和鉴定 |
| 2.4 EmiMIC2重组蛋白的表达及纯化 |
| 2.5 大鼠抗rEmiMIC2抗体效价的检测 |
| 2.6 免疫印迹分析重组和天然蛋白EmiMIC2 |
| 2.7 免疫荧光检测EmiMIC2在子孢子和裂殖子时期的表达 |
| 2.8 重组蛋白rEmiMIC2抗E.mitis的免疫保护性 |
| 2.9 免疫rEmiMIC2后鸡血清中IgG水平检测 |
| 2.10 免疫rEmiMIC2后鸡血清中细胞因子水平检测 |
| 2.11 脾淋巴细胞中细胞因子转录水平的检测 |
| 2.12 免疫rEmiMIC2后鸡脾淋巴细胞中CD4~+和CD8~+T细胞的变化 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 EmiEtmic-2/7h的分子鉴定及免疫保护性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 EmiEtmic-2/7h基因的扩增和序列分析 |
| 2.2 EmiEtmic-2/7h序列同源性分析 |
| 2.3 重组表达质粒pET-32a-EmiEtmic-2/7h的构建和鉴定 |
| 2.4 EmiEtmic-2/7h重组蛋白的表达及纯化 |
| 2.5 大鼠抗rEmiEtmic-2/7h抗体效价的检测 |
| 2.6 免疫印迹分析重组和天然蛋白EmiEmic-2/7h |
| 2.7 免疫荧光检测EmiEtmic-2/7h在子孢子和裂殖子时期的表达 |
| 2.8 重组蛋白rEmiEtmic-2/7h抗E.mitis的免疫保护性 |
| 2.9 免疫rEmiEtmic-2/7h后鸡血清中IgG水平检测 |
| 2.10 免疫rEmiEtmic-2/7h后鸡血清中细胞因子水平检测 |
| 2.11 脾淋巴细胞中细胞因子转录水平的检测 |
| 2.12 免疫rEmiEtmic-2/7h后鸡脾淋巴细胞中CD4~+和CD8~+T细胞的变化 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 EmiAMA1的分子鉴定及免疫保护性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 EmiAMA1基因的扩增和序列分析 |
| 2.2 EmiAMA1序列同源性分析 |
| 2.3 重组表达质粒pET-32a-EmiAMA1的构建和鉴定 |
| 2.4 EmiAMA1重组蛋白的表达及纯化 |
| 2.5 大鼠抗rEmiAMA1抗体效价的检测 |
| 2.6 免疫印迹分析重组蛋白EmiAMA1 |
| 2.7 免疫荧光检测EmiAMA1在子孢子和裂殖子时期的表达 |
| 2.8 重组蛋白rEmiAMA1抗E.mitis的免疫保护性 |
| 2.9 免疫rEmiAMA1后鸡血清中IgG水平检测 |
| 2.10 免疫rEmiAMA1后鸡血清中细胞因子水平检测 |
| 2.11 脾淋巴细胞中细胞因子转录水平的检测 |
| 2.12 免疫rEmiAMA1后鸡脾淋巴细胞中CD4~+和CD8~+T细胞的变化 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第八章 微线蛋白及其结构域在E.mitis子孢子侵入过程中的作用 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.0 EmiMARs的PCR扩增 |
| 2.1 重组表达质粒pET-32a-EmiMARs的鉴定 |
| 2.2 重组蛋白EmiMARs的表达与纯化 |
| 2.3 重组蛋白rEmiMIC3与鸡小肠后段上皮细胞的结合 |
| 2.4 重组EmiMIC3-MARs结构域蛋白与鸡小肠后段上皮细胞结合的能力 |
| 2.5 EmiMICs与鸡不同肠段的结合能力 |
| 2.6 EmiMARs与鸡不同肠段的结合能力 |
| 2.7 子孢子侵入的抑制 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 博士期间论文发表情况 |
（7）allo-HSCT后急性移植物抗宿主病患者外周血树突状细胞TSP-1的表达变化及意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）Rev-erbβ相互作用分子的验证及Rev-erbβ功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 Rev-erbβ的结构和基因定位 |
| 1.1.1 Rev-erbβ结构 |
| 1.1.2 Rev-erbβ基因的定位和组织分布 |
| 1.2 Rev-erbs的转录调节机制 |
| 1.2.1 核受体转录调节机制 |
| 1.2.2 核受体Rev-erbs转录调节机制 |
| 1.3 天然配体及人工合成配体对Rev-erbβ功能的影响 |
| 1.3.1 Rev-erbβ天然配体的发现及转录调控机制 |
| 1.3.2 人工合成配体对Rev-erbβ功能的影响 |
| 1.4 Rev-erbβ的生物学功能 |
| 1.4.1 Rev-erbβ参与调节生物昼夜节律 |
| 1.4.2 Rev-erbβ与脂质代谢 |
| 1.4.3 Rev-erbβ与糖代谢 |
| 1.4.4 Rev-erbs参与生理节律及能量代谢 |
| 1.4.5 Rev-erbβ与炎症 |
| 1.4.6 Rev-erbβ与肿瘤 |
| 1.5 颗粒前体蛋白(Progranulin,PGRN) |
| 1.5.1 PGRN分子概述 |
| 1.5.2 与PGRN相互作用的分子 |
| 1.6 结语 |
| 第2章 针对人Rev-erbβ单克隆抗体的制备 |
| 2.1 材料和仪器 |
| 2.1.1 细胞和载体 |
| 2.1.2 实验主要材料和试剂 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 人Rev-erbα及Rev-erbβ基因的克隆 |
| 2.2.2 大肠杆菌E.coli DH5和E.coli BL21 DE3感受态细胞的制备 |
| 2.2.3 携带有目的基因片段的克隆载体转化、涂布培养及阳性克隆的筛选 |
| 2.2.4 携带hRev-erbβ-6His、hRev-erbβ-Flag和hRev-erbα-Flag表达载体的构建 |
| 2.2.5 PCR扩增Rev-erbβ基因的截短体及其相关载体的构建与表达 |
| 2.2.6 hRev-erbβ-6His重组蛋白的原核表达与纯化 |
| 2.2.7 Rev-erbβ单克隆抗体的制备 |
| 2.2.8 细胞培养、质粒转化及细胞裂解液的制备 |
| 2.2.9 Western blot检测 |
| 2.2.10 免疫荧光细胞染色(Immunofluorescen cytochemistry)检测 |
| 2.2.11 免疫沉淀实验(Immunoprecipitation,IP)分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 人Rev-erbβ及Rev-erbα基因克隆的结果 |
| 2.3.2 构建hRev-erbβ-6His、hRev-erbβ-Flag和hRev-erbα-Flag表达载体的结果 |
| 2.3.3 hRev-erbβ-6His原核诱导表达、纯化及鉴定结果 |
| 2.3.4 构建hRev-erbβ基因截短体相关载体和诱导GST融合蛋白表达的结果 |
| 2.3.5 Rev-erbβ单克隆抗体的鉴定结果 |
| 2.3.6 Rev-erbβ单抗识别Rev-erbβ特定结构域的检测结果 |
| 2.3.7 Rev-erbβ单抗检测内源Rev-erbβ表达的结果 |
| 2.3.8 Rev-erbβ的单抗与人源Rev-erbα蛋白的交叉反应 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 Rev-erbβ与PGRN相互作用的验证及其结合部位的确定 |
| 3.1 实验的主要材料、试剂和仪器 |
| 3.1.1 所用的细胞系和主要载体 |
| 3.1.2 实验所用的主要仪器设备 |
| 3.1.3 实验材料和试剂 |
| 3.1.4 实验试剂的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 本实验所用的相关载体的构建 |
| 3.2.2 利用酵母双杂交系统验证Rev-erbβ与PGRN的相互作用 |
| 3.2.3 Rev-erbβ与PGRN的相互作用结合部位的确定 |
| 3.2.4 利用免疫共沉淀法(Co-IP)检测Rev-erbβ与PGRN的相互作用 |
| 3.2.5 利用GST- pull down验证Rev-erbβ与PGRN的相互作用 |
| 3.2.6 Rev-erbβ、PGRN在细胞内的共定位情况的检测 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 本章实验所构建相关载体的结果 |
| 3.3.2 Rev-erbβ与PGRN的相互作用的验证结果 |
| 3.3.3 GST-pull down验证Rev-erbβ与PGRN相互作用的结果 |
| 3.3.4 免疫共沉淀验证Rev-erbβ与PGRN的相互作用的结果 |
| 3.3.5 Rev-erbβ与PGRN在细胞内的共定位研究结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 PGRN对Rev-erbβ靶基因表达调控的分子机制研究 |
| 4.1 实验主要材料 |
| 4.1.1 细胞系和菌株 |
| 4.1.2 主要载体和质粒 |
| 4.1.3 本章实验中所用到的引物 |
| 4.1.4 主要试剂 |
| 4.1.5 主要溶液的配制 |
| 4.1.6 主要仪器及设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 GAL4(BD)-Rev-erbβ-E/6×UAS-CMV-Luciferase检测系统的构建 |
| 4.2.2 相关启动子克隆、载体构建及活性检测 |
| 4.2.3 Rev-erbβ和PGRN基因双敲除HEK293细胞系的构建 |
| 4.2.4 PGRN介导Rev-erbβ对靶基因转录活性调控的影响 |
| 4.2.5 细胞培养 |
| 4.2.6 细胞总RNA的提取 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 GAL4 (BD)-Rev-erbβ-E与6×UAS-CMV/SV40-Luciferase检测统构建结果 |
| 4.3.2 相关启动子克隆、载体构建及活性检测结果 |
| 4.3.3 Rev-erbβ和PGRN基因双敲除的HEK293细胞系的构建 |
| 4.3.4 PGRN与Rev-erbβ相互作用对靶基因转录活性调控影响的结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 Rev-erbβ在肝癌HepG2细胞中功能的研究 |
| 5.1 实验主要材料 |
| 5.1.1 细胞系和菌株 |
| 5.1.2 主要载体和质粒 |
| 5.1.3 本章实验中所用到的引物 |
| 5.1.4 主要试剂 |
| 5.1.5 主要溶液的配制 |
| 5.1.6 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 HepG2相关细胞系的构建 |
| 5.2.2 细胞RNA提取、反转录及Real time PCR |
| 5.2.3 MTT法检测细胞的增殖活性 |
| 5.2.4 划痕和Transwell检测细胞迁移能力 |
| 5.2.5 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力 |
| 5.2.6 腺病毒pAd5-E1-CMV-Rev-erbβ回补实验 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 Rev-erbβ基因敲除HepG2细胞系的构建与鉴定结果 |
| 5.3.2 Rev-erbβ在肝癌HepG2细胞中功能研究结果 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间科研成果 |
（9）基于多组学的补肾活血方防治绝经后骨质疏松症机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 绪论 |
| 1 骨重建 |
| 2 参与骨形成的细胞信号通路 |
| 3 骨髓间充质干细胞（Bone Mesenchymal stem cells，BMSCs）的骨向分化 |
| 4 治疗OP药物现状 |
| 5 补肾复方促BMSCs骨向分化的中医理论基础 |
| 6 TKABF的前期研究 |
| 7 多组学在中药复方中的应用 |
| 8 课题的研究思路 |
| 实验一 rBMSCs的培养鉴定及TKABF药效评价 |
| 1. 研究目的 |
| 2. 实验材料 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 实验结果 |
| 5. 讨论 |
| 6. 小结 |
| 实验二 TKABF干预正常大鼠的血浆代谢组研究 |
| 1. 研究目的 |
| 2. 实验材料 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 实验结果 |
| 5. 讨论 |
| 6. 小结 |
| 实验三 csTKABF干预正常大鼠BMSCs的信号通路筛选 |
| 1. 研究目的 |
| 2. 实验材料 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 实验结果 |
| 5. 讨论 |
| 6. 小结 |
| 实验四 TKABF干预去卵巢OP大鼠的血清蛋白组研究 |
| 1. 研究目的 |
| 2. 实验材料 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 实验结果 |
| 5. 讨论 |
| 6. 小结 |
| 实验五 csTKABF干预去卵巢OP大鼠BMSCs的转录组研究 |
| 1. 研究目的 |
| 2. 实验材料 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 实验结果 |
| 5. 讨论 |
| 6. 小结 |
| 全文讨论 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 缩略语 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）C1ql1和C1ql4促进新生血管形成的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 血管新生 |
| 1.2 C1q家族的研究进展 |
| 1.3 C1qls蛋白的研究进展 |
| 1.4 本论文的研究目的及意义 |
| 1.5 本论文的研究内容及技术路线 |
| 第二章 C1ql1和C1ql4调控人脐带静脉内皮细胞血管新生的研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 重组蛋白的纯化 |
| 2.3.2 人HUVECs的分离培养及鉴定 |
| 2.3.3 重组蛋白g1ql1和gC1ql4对HUVECs迁移能力的影响 |
| 2.3.4 重组蛋白gC1ql1和gC1ql4蛋白对HUVECs管状结构能力形成的影响 |
| 2.3.5 重组蛋白gC1ql1和gC1ql4作用于HUVECs后ERK1/2 信号通路的变化 |
| 2.3.6 MEK抑制剂对gC1ql1和gC1ql4诱导的细胞迁移的影响 |
| 2.3.7 MEK抑制剂对gC1ql1和gC1ql4诱导的管状形成的影响 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 gC1ql1和gC1ql4蛋白促进鸡胚卵黄囊膜血管的新生 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 TRX蛋白对鸡胚卵黄囊膜血管的生成无促进或抑制作用 |
| 3.3.2 gC1ql1蛋白促进鸡胚卵黄囊膜血管的生成 |
| 3.3.3 gC1ql4蛋白促进鸡胚卵黄囊膜血管的生成 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 gC1ql1和gC1ql4调控大鼠心脏微血管内皮细胞血管新生机制研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 可溶性非融合gC1ql1和gC1ql4的制备 |
| 4.3.2 gC1ql1和gC1ql4作用于CMECs后ERK1/2 信号通路的变化 |
| 4.3.3 MEK抑制剂对gC1ql1和gC1ql4蛋白诱导CMECsERK1/2信号通路的影响 |
| 4.3.4 MEK抑制剂对gC1ql1和gC1ql4蛋白诱导的细胞迁移的影响 |
| 4.3.5 MEK抑制剂对gC1ql1和gC1ql4蛋白诱导的CMECs管状结构形成的影响 |
| 4.3.6 基因芯片对重组蛋白gC1ql4作用靶基因的确定 |
| 4.3.7 Realtime PCR对部分差异基因验证 |
| 4.3.8 gC1ql1对缺氧复苏后CMECs细胞活力的影响 |
| 4.3.9 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测gC1ql1蛋白对缺氧复苏后CMECs细胞凋亡的影响 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 讨论 |
| 5.1 C1q球状结构域与血管新生 |
| 5.2 C1qls调控血管新生信号通路 |
| 5.3 C1qls促进血管新生的基因调控模式 |
| 5.4 C1ql1对CMECs缺氧保护 |
| 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表 |
| 致谢 |
| 特别鸣谢 |
四、Expression, purification of a synthetic fuse-protein-TSF from PF4 and TSP1 fragments and its effect on angio-genesis and tumor growth（论文参考文献）
- [1]EFEMP1与IZUMO1的相互作用及对受精的影响[D]. 张文君. 内蒙古大学, 2021(12)
- [2]凝血酶敏感蛋白-1与血管新生[J]. 王继红,于光远,姜颖. 辽宁师范大学学报(自然科学版), 2021(01)
- [3]细粒棘球绦虫TSP8、TSP11基因的原核表达及免疫学初步分析[D]. 王炜烨. 石河子大学, 2020(08)
- [4]天然产物flavaglines对红白血病的抑制作用及机制研究[D]. 宋佳蕾. 重庆大学, 2019(01)
- [5]新型全人源化CD47单抗抗白血病效应及调控CD47表达的机制研究[D]. 王超雨. 天津医科大学, 2019(02)
- [6]鸡和缓艾美耳球虫微线蛋白在侵入部位特异性中的作用[D]. 黄欣梅. 南京农业大学, 2018(07)
- [7]allo-HSCT后急性移植物抗宿主病患者外周血树突状细胞TSP-1的表达变化及意义[D]. 刘飞. 泰山医学院, 2017(06)
- [8]Rev-erbβ相互作用分子的验证及Rev-erbβ功能研究[D]. 陈芳. 陕西师范大学, 2017(04)
- [9]基于多组学的补肾活血方防治绝经后骨质疏松症机制研究[D]. 方霁. 暨南大学, 2016(12)
- [10]C1ql1和C1ql4促进新生血管形成的机制研究[D]. 刘芳. 暨南大学, 2016(04)