一、糖基化白蛋白液中糖含量的不同定量方法比较（论文文献综述）
戴士杰[1]（2021）在《长效化胰高血糖素样肽-1类似物设计、合成及降糖活性研究》文中认为胰高血糖素样肽-1（GLP-1）及其类似物（如Exendin-4,Ex4）是多肽类肠降血糖素药物,已广泛用于治疗2型糖尿病（T2DM）。目前,临床上使用基于GLP-1/Exendin-4多肽作为治疗糖尿病药物的一个主要挑战是,多肽易被蛋白酶降解和快速被肾脏清除等固有的属性,导致其在体内的半衰期很短、成药性差,临床上需要通过高剂量和增加给药频率来达到治疗效果。目前已发展了多种策略用于改善GLP-1多肽药物的药代动力学性质,主要包括聚乙醇化修饰、长链脂肪酸或其他小分子修饰提高与白蛋白的相互作用、GLP-1多肽与白蛋白或Fc的融合表达等。然而,上述策略在改善GLP-1及其类似物药代动力学性质的同时,也产生一些新的问题和挑战,如免疫原性,产品的均一性以及制备工艺的复杂化等问题。研究具有新型作用机制的GLP-1类似物可提高T2DM的治疗效果和作用窗口。本论文以临床批准的GLP-1多肽Exendin-4为模型,基于正交化学和分选酶（Sortase A,Srt A）的定点修饰技术,探索了葡聚糖和半抗原定点修饰新策略用来改善Exendin-4的药代动力学性质,提高其长效降糖活性;论文最后运用丝氨酸/苏氨酸连接（Ser/Thr ligation,STL）策略和重组表达技术相结合,发展了半合成方法合成索玛鲁肽。主要结果如下:（1）通过肟连接化学对“化学突变”的Ex4类似物（Ex4-12K*,Ex4-27K*,Ex4-12-27K*）进行葡聚糖定点修饰,延长Ex4的长效降糖效果。通固相多肽合成技术对Ex4多肽12,27和12/27位进行“化学突变”,制备成含羟胺赖氨酸的Ex4类似物,借助正交肟连接化学将不同分子量的葡聚糖（Mw=6000 Da和20000 Da）定点地修饰到Ex4多肽类似物含羟胺的赖氨酸上,成功地构建了六种均一葡聚糖-Ex4（dextran-Ex4）偶联物。体外受体结合实验和腹腔糖耐量实验（IPGTT）显示葡聚糖修饰的位点对胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）激活能力和急性降血糖能力有显着影响,其中对Ex4的12位进行葡聚糖修饰对其GLP-1R激活能力影响最小,完全保留了Ex4促进胰岛素分泌进而调节血糖的能力。长效降血糖实验结果表明,除了dextran-Ex4-12K*-27K*（6000）,其他dextran-Ex4偶联物的长效降血糖能力均得到提高,且修饰的位点以及用于修饰的葡聚糖分子量大小对长效降糖作用效果都有显着影响。构效关系研究结果表明:dextran-Ex4-12K*（20000）在第4、6、8、12以及24小时的血糖水平以及最终的AUC glucose 0-24h值保持最低,表明dextran-Ex4-12K*（20000）具有最优的长效降糖作用。（2）设计和合成新型小分子半抗原DNP定点修饰的Exendin-4类似物Ex4-DNP,发展了半抗原DNP作为内源性抗体粘合剂用以延长Ex4半衰期的新策略。通过Srt A介导的连接反应（SML）制备三种含不同长度连接臂的Ex4-DNP偶联物6-8和FITC标记的Ex4-DNP偶联物9-11。体外细胞GLP-1R激活实验结果显示DNP定点修饰会导致其刺激GLP-1R的能力略有下降,但EC50值仍保持在纳摩尔水平（6:1.39 n M;7:1.98 n M;8:4.03 n M）。药代动力学实验结果表明,当体内存在丰富的抗DNP抗体时,使用半抗原DNP对Ex4进行修饰可以显着延长其半衰期。其中含有中等长度PEG连接臂的偶联物10的半衰期达到了3.55小时,是相同条件下未修饰Ex4的4.9倍。此外,Ex4-DNP偶联物在预免疫的db/db小鼠模型的长效降糖活性相比于在未预免疫的db/db小鼠模型显着增强,其中含有PEG3连接臂的偶联物7表现出最好的长效降血糖效果,这与药代动力学实验结果一致。最后在长期治疗实验中,与每天两次皮下注射未修饰的Ex4相比,每天一次皮下注射Ex4-DNP偶联物7在改善糖基化血红蛋白（HbA1c）、葡萄糖耐量、脂质代谢和保护胰岛方面表现出更有益的作用,并且无明显的毒性作用和免疫原性。（3）设计和合成新型半抗原鼠李糖脂定点修饰的Exendin-4类似物Ex4-Lipid-Rha,发展了半抗原鼠李糖作为内源性抗体粘合剂和脂肪链作为白蛋白粘合剂双重作用机制延长Exendin-4半衰期的新策略。通过化学酶法SML反应成功构建Ex4-Lipid-Rha偶联物5-7。体外细胞GLP-1R激活实验表明鼠李糖脂修饰导致其激活GLP-1R的能力略有下降,但EC50值仍保持在亚纳摩尔水平（5:0.14 n M;6:0.19 n M;7:0.21 n M）。体内IPGTT实验证明,对Ex4的C端进行鼠李糖脂修饰不会影响其促进胰岛素分泌和急性降血糖的活性。长效降血糖实验结果表明在没有对db/db糖尿病小鼠模型进行Rha-OVA预免疫之前,Ex4-Lipid-Rha偶联物5-7的长效降血糖能力均获得一定的增强;另一方面,对db/db糖尿病小鼠模型进行Rha-OVA预免疫之后,偶联物5-7的长效降血糖能力进一步得到增强,此时的增益效果要不仅归因于脂肪链与体内白蛋白的相互作用,还得益于半抗原Rha与内源性抗体的相互作用。（4）建立了基于STL化学连接的半合成法制备长效降糖药物索马鲁肽。从溶剂、温度、助溶剂和投料比等方面优化了四肽水杨醛酯2和Arg34 GLP-1（11-37）之间的STL反应,最终确定在1:120比例的吡啶-醋酸缓冲体系（mol/mol）,反应温度为40°C,Arg34GLP-1（11-37）与2的当量比为1:3.76,以及不添加任何助溶剂的条件下,以85%的转化率成功制备索马鲁肽骨架;在此基础之上,进一步优化了索马鲁肽骨架中Lys26的侧链氨基与长链脂肪酸的选择性偶联反应条件,对反应体系的种类,反应液p H值以及酰化剂滴加速度进行了筛选,最终确定以50 m M H3BO3（p H=10.5）反应体系,酰化试剂滴加速度为0.5小时作为最佳条件,上述酰化反应的转化率大于99%;最后脱除保护基后,从质谱和细胞水平的生物活性方面证明利用本方法合成的索马鲁肽和原研药一致。
李雪[2]（2020）在《质谱鉴定中药阿胶的胶原蛋白和糖胺聚糖及研究糖胺聚糖与趋化因子的相互作用》文中认为胶类中药是动物类中药的重要组成,其中阿胶（Colla Corii Asini,CCA）的生产规模和市场销量都处于领先。CCA的药理作用主要为改善代谢平衡、滋阴补血和调节免疫功能。CCA中的生物大分子主要为蛋白质和糖胺聚糖（Glycosaminoglycan,GAG）,目前对于CCA的研究还不够全面,因此本论文的第一个目标是研究CCA中生物大分子的结构,研究皮样和胶样中蛋白及糖胺聚糖的组成,建立相关的质谱分析方法。GAG与蛋白的相互作用在生物体内发挥重要功能。在CCA研究中我们对蛋白序列和GAG糖单元进行了分析,但GAG和蛋白的相互作用研究需要更复杂的质谱分析方法和其它新的技术。通过CCA建立的质谱分析方法可对蛋白和GAG进行初步的分析,而对于复杂的糖蛋白混合物的序列长度、糖基化种类、糖链、糖基化位点的定性及定量还需要在其基础上进一步的方法开发。因此本文的剩余篇幅聚焦于复杂度更高的糖蛋白异型体的分析方法开发以及结合生物膜干涉技术（Bio-layer Interferometry,BLI）和亲和柱技术的GAG与趋化因子的相互作用研究。GAG与趋化因子的相互作用与多种生理病理过程相关,我们选择趋化因子5（Chemokine ligand 5,CCL5）作为模式分子建立相关分析方法。CCL5是趋化因子家族的一种。趋化因子是指一些低分子量（6-14kDa）的碱性蛋白,因其定向趋化吸引白细胞迁移到感染部位而在炎症反应中具有重要作用。CCL5又称调节活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子（Regulated on activation normal T cell expressed and secreted,RANTES）,从属于CC类趋化因子亚族（β类趋化因子）。CCL5与其受体结合,可以抑制HIV病毒进入细胞。但是由于CCL5同样影响炎症作用,因此药物设计一般希望通过调控CCL5的修饰改变炎性作用,并且不影响其抑制病毒进入的作用。CCL5与GAG的结合,是CCL5形成趋化因子梯度,发挥趋化性质的先决条件,同时也是CCL5与受体发生相互作用的前提。因此,对CCL5与GAG相互作用的研究具有重要意义。我们首先建立质谱分析方法了解人体内天然CCL5的结构及组成,然后合成15种不同截短型与糖基化修饰的CCL5异型体,开发相应的定性及定量质谱分析方法,最后应用此分析方法研究不同CCL5与GAG在不同情况下的相互作用,探究并解释相互作用的机理。本论文的主要研究成果如下:1.建立了一种CCA来源鉴定的方法对CCA的主要蛋白进行分析,并建立了 CCA来源鉴定的方法。通过鸟枪法蛋白组学研究不同物种驴马牛猪的皮样蛋白,确定主要蛋白为胶原蛋白,通过羟基化修饰搜索对应物种的数据库,发现胶原蛋白是严重羟基化的。选择主要成分胶原蛋白作为研究对象,通过生物信息学比较不同物种的I型胶原蛋白序列,以推测每种物种理论的特征序列。对皮样的酶解样品进行质谱分析,提取理论特征序列的母离子,根据筛选条件确定每个物种的特征肽,并在胶样样品中提取到了对应的特征肽,从而确证特征肽的可行性。合成对应的特征肽并建立对应特征肽检测的多反应监测（Multiple Reaction Monitoring,MRM）方法,提高了方法灵敏度,并通过分析掺假样品和商品CCA进行了方法确证及应用。最终通过此方法可以检测到掺假0.5%的CCA,并且可以使用此方法特异性地区分驴、马和杂交物种骡子,从而排除其掺假的可能性。2.分析了驴皮降解过程中糖胺聚糖的变化将驴皮和CCA水解物脱脂后进行蛋白酶解,将大部分蛋白除去,然后通过阳离子交换柱收集GAG,使用肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和CSABC酶将提取的GAG完全酶解为二糖,建立二糖的LC-MRM-MS/MS方法,将标准品和样品的二糖提取离子峰的峰面积积分,得到驴皮和CCA中的二糖组成及含量。我们对于驴皮制作为CCA的过程中GAG的作用有了基本的了解,发现硫酸皮肤素相对于硫酸乙酰肝素来说在CCA中含量多且稳定性强,推测其对于CCA的功效可能起到更重要的作用。3.人血浆中CCL5的富集及分析方法文献报道CCL5存在两个可能的O-糖基化位点及1-68,3-68,4-68三种不同的肽链长度,因此我们建立方法鉴定人血浆中天然CCL5的形式。血浆中CCL5的含量极低,因此首先使用自制CCL5的多抗琼脂糖凝胶亲和柱,富集人血浆中的CCL5,并进行质谱分析。最终我们鉴定到三种不同氨基酸长度的CCL5形式。而对于血浆中CCL5是否存在O糖基化,使用自制VVA凝集素亲和柱将样品中的O-GalNAc糖肽富集,并加入理论蛋白量的5%的内标同位素糖肽,最终通过质谱鉴定到加入的内标糖肽,验证了方法的可行性,但是没鉴定到糖基化CCL5的相关糖肽,说明人血浆中CCL5的糖基化形式低于5%。后续可以使用此方法分析CCL5含量较多的生物样品,从而对CCL5糖基化结构进行表征。4.建立CCL5异型体结构的定性定量方法由于人血浆中的CCL5的含量极低,因此根据CCL5的结构形式,设计并化学合成了 15种糖基化CCL5,包括不同氨基酸长度,不同糖基化和不同糖基化位点等差异。鉴定15种CCL5异型体的难点在于其中存在6组只有糖基化位点不同的同分异构体,由于这6组同分异构体的细小差异,色谱柱无法实现区分,而电子转移裂解（Electron Transfer Dissociation,ETD）碎裂可以保留糖链的完整性,在Ser4和Ser5之间产生特征的c/z碎片离子,从而鉴定位点差异的同分异构体。选择外标法作为定量方法,首先通过高能碰撞诱导（Higher Energy Collision Induced Dissociation,HCD）碎裂确定蛋白序列,根据m/z的不同将一级质谱信息分为9组,然后将其中质量相同的6组采用ETD碎裂方式通过特征碎片离子定量。因此我们结合质谱的HCD和ETD碎裂方式进行了全部CCL5异型体的鉴定和定量,从而建立了区分微小差异的同分异构糖蛋白的方法。将此方法首先用于CCL5-1和CCL5-7混合物过肝素柱后的洗脱液分析。CCL5-1是1-68序列长度且非糖基化的CCL5,CCL5-7是3-68序列长度且Ser4带GalNAc的,因此实验结果表明不同结构的CCL5与肝素的相互作用是有区别的,这为后续研究建立了基础。5.探究了 CCL5与肝素的相互作用及机理为了探究单类CCL5与肝素的相互作用,使用BLI,利用光的干涉原理,分析每种CCL5与肝素的相互作用,测定不同的KKD值。根据BLI的测定原理,KD值越小的相互作用越紧密,亲和力作用越大。将CCL5结构与KD值结合分析,结果表明,对于三个非糖基化异型体的形式,当两个氨基酸残基被截短时,结合亲和力略有降低,而如果再缺少一个氨基酸残基,则结合亲和力略有增加,说明截短与否对亲和力影响不大。Ser-5位置比Ser-4位置更为关键。在聚糖结构方面,与单糖残基相比,二糖残基通常对肝素结合具有更明显的影响。使用分子模型软件对CCL5-11、CCL5-14和CCL5-15与肝素八糖进行了分子对接模拟,发现Ser5和二糖糖基化通过影响CCL5与肝素的结合位点及结合碱性氨基酸的个数,从而影响了其相互作用的强度。为了探究混合情况下CCL5与肝素的相互作用,将不同CCL5混合过肝素亲和柱,收集出峰时的洗脱液,使用开发的分析方法进行定性定量,通过每个CCL5的洗脱量的不同,结合其结构分析,结果显示,不同的氨基酸序列改变,不同位置和种类的糖基化修饰,会对肝素亲和力产生各种不同的影响。同时,在不同组合中,各个异型体的相对亲和力保持一致。这表明某种修饰对CCL5异型体与肝素亲和力强度的排序是稳定的,不受不同的混合物组成的影响。但是由于其它异构体的影响,混合物中某类CCL5的亲和力与单类异构体的作用结果是不一样的。不管是单独结合还是混合结合,CCL5的Ser5糖基化位点带二糖的糖基化修饰对于CCL5与肝素相互作用的性质影响较大且稳定性较好,这些结果为我们提供了有关如何通过专门设计糖基化异型体来改变CCL5的生物活性的指导。综合本论文,我们首先建立质谱分析方法研究中药CCA的胶原蛋白和GAG,开发了 CCA来源鉴定的特征肽方法（已由山东省食品药品检验研究院申请中国药典的CCA补充检验方法）,可以鉴定掺假0.5%的样品且区分驴、马和骡。然后,我们对CCA中的GAG糖单元进行了组成及含量分析。GAG和蛋白的相互作用与生物体内多种生理过程相关,我们选择肝素与CCL5的相互作用进行研究。首先使用CCA建立的质谱分析方法分析了人血浆中天然的CCL5。由于天然CCL5含量太低,为了分析复杂的糖蛋白混合物及研究GAG与CCL5的相互作用,我们合成了 15种存在序列长度、糖链和糖基化位点差异的CCL5异型体,并在CCA鉴定中积累的序列和糖单元分析方法基础上进一步开发了 CCL5异型体混合物的分析方法。通过BLI测定肝素与每种CCL5的亲和常数,采用开发的质谱分析方法对CCL5不同混合形式过肝素柱的洗脱液定性定量。综合BLI分析结果,我们发现Ser5带二糖这个结构对CCL5与肝素的相互作用影响较大。
王菁[3]（2020）在《海带低分子量褐藻多糖硫酸酯对糖尿病肾病的作用机制研究》文中研究说明糖尿病肾病（DN）是主要的糖尿病微血管疾病,是最早出现的糖尿病并发症,也是慢性肾衰和终末期肾病需要透析的最主要病因。DN是糖尿病持续高血糖引起的代谢障碍并发症,其产生过程与多种病理过程相关。从海带中提取的低分子量褐藻多糖硫酸酯（LMWF）属于一类高度硫酸化杂多糖,由岩藻糖、硫酸基、半乳糖等组成。LMWF因结构独特具有多种生物活性,包括抗凝血、抗炎症、抗氧化、抗肿瘤等。LMWF作为天然褐藻多糖通过影响多种细胞因子抑制DN的发展速度,但LMWF对DN的治疗机制尚不清楚。本论文从体外细胞模型水平与体内动物模型水平入手,探讨LMWF改善DN的作用与机制。体外细胞实验结果证明LMWF能够显着改善晚期糖基化终末产物（AGEs）引发的人体肾小球系膜细胞（HRMCs）异常增殖与肥大,降低细胞培养基中内毒素含量与乳酸脱氢酶（LDH）活性,从而改善HRMCs损伤;通过定量蛋白质组学KEGG富集分析,发现细胞外基质-受体相互作用（ECM-receptor interaction）信号通路与LMWF关联性最大,其中纤维连接蛋白（FN）表达量变化受LMWF影响最显着;通过细胞免疫荧光和表面等离子体共振（SPR）检测发现LMWF与FN存在特异性结合,平衡解离常数KD为453.7μmol/L;结果证明带正电荷的鱼精蛋白硫酸盐（PS）能够促进LMWF与HRMCs结合,增强LMWF改善HRMCs损伤的治疗作用。在体内动物实验方面,通过STZ诱导成年雄性Wistar大鼠建立DN早期模型证实LMWF较微晶纤维素（MC）可更好地缓解DN大鼠多饮、多食、体态消瘦等症状,但其对血清生化指标影响不大,未产生明显改善DN大鼠高血糖的效果。在肾脏功能方面,LMWF能够明显改善DN大鼠多尿、尿蛋白排泄量过多、尿微量白蛋白与尿肌酐比值（ACR）过高等DN早期病理症状;能够抑制肾小球基底膜病变,阻止肾小球系膜及基底膜增厚,缓解肾小球结构病变,下调DN大鼠肾皮质层FN、肌营养不良聚糖蛋白（DG）、层粘连蛋白（LAMC1）、白细胞介素-6（IL-6）、细胞间黏附分子-1（ICAM1）等促炎症因子的水平,而LMWF与抗生素（Anti）联用时其改善DN的效果受到影响且大幅降低。LMWF能够改善DN大鼠肾脏功能损伤,降低肾脏组织因炎症引起的病变,且这种作用与肠道菌群相关。体内动物实验结果证实LMWF能够显着抑制DN大鼠肠道通透性增大、粪便量增多、结肠长度缩短等肠道功能损伤症状。通过对DN大鼠粪便16S r DNA测序并进行聚类统计分析,结果证明LMWF显着提高拟杆菌门（Bacteroidetes）丰度并降低厚壁菌门（Firmicutes）丰度,缓解DN大鼠肠道菌群紊乱,显着提高拟杆菌目S24-7（Bacteroidales S24-7 group）和瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）等可产生短链脂肪酸（SCFAs）的菌种丰度,且LMWF对DN的治疗作用与肠道菌群存在关联性。综上所述,LMWF能够有效缓解DN细胞病变及肾脏损伤,其通过结合FN抑制细胞外基质-受体相互作用信号通路,缓解由AGEs引起的HRMCs异常增殖与肥大,LMWF能够调节肠道菌群结构并抑制肠道屏障损伤,下调肾脏FN和IL-6等ECM相关的促炎症因子水平,减轻肾脏病理改变程度。本研究结果为进一步探讨褐藻多糖等治疗DN的作用机理及开发大分子活性物质作为海洋药物提供参考。
纪德铭[4]（2020）在《人C1酯酶抑制剂制备工艺及检测方法的优化》文中提出目的:探究利用全血浆层析工艺中间产物作为一种新的人C1酯酶抑制剂（C1esterase inhibitor,C1-INH）提取原料的方法;对现有从人血浆中提取具有活性C1-INH的层析方法进行优化,提升C1-INH的回收率及比活力,同时保证工艺稳定性;对PIerceTM BCA蛋白定量分析试剂盒进行方法及标准品改良,并首次采用改良的BCA法对C1-INH工艺小试样品进行检测。方法:本工艺的C1-INH制备原料为经过超滤的IgG亲和层析的流穿液（flow through,FT）,其主要杂质蛋白为免疫球蛋白M（Immunoglobulin M,IgM）。采用聚乙二醇（polyethylene glyco,PEG）沉淀法对杂质蛋白进行初步去除,设置不同pH的C1-INH制备原料实验组,对PEG 4000浓度、沉淀pH条件及离心参数进行摸索/分组试验,对离心后上清液中目标蛋白C1-INH和IgM等其他杂质蛋白含量进行抗原含量及相关检测,确定PEG沉淀纯化C1-INH的最佳条件。将离心后上清液调节进行羧甲基琼脂糖（CM Sepharose Fast Flow,CM）离子交换层析,对杂质蛋白进一步去除,并使用不同盐离子浓度的洗脱液对活性与非活性C1-INH进行分离。采用C1-INH活性动态显色（C1-INH-inhouse）法对产物活性进行检测,结合特定蛋白检测,测定产物比活力,确定最佳的分离盐离子浓度。将PIerceTM BCA蛋白定量分析试剂盒的试管法与微孔板法结合,并用一次函数和二次函数两种方式进行标准曲线拟合,确定最适拟合曲线,并将PIerceTM BCA蛋白定量分析试剂盒配备的牛血清白蛋白（BSA）标准品与C1-INH纯品（Calbiochem）进行相互标定并计算各自回收率,拟以C1-INH纯品代替BSA标准品对工艺小试样品进行检测,并与抗原的特定蛋白检测结果进行比较。结果:通过pH与PEG浓度组合筛选,确定在弱酸性pH（6.8）条件下,当PEG质量分数为12%,离心条件15000g,20 min,25℃时,IgM的去除效果较好,特定蛋白检测结果显示与原料相比IgM去除率达99%以上,且C1-INH的回收率达80%以上。经CM离子交换层析,有活性的C1-INH主要集中在盐离子浓度为200 mmol/L的洗脱液中,产物中C1-INH的比活力达到最大（4.43 IU/mg）,其余样品中不含活性成分或活性成分含量低于检测下限,且杂质蛋白去除率达到99%以上。改良的BCA法采用二次函数拟合标准曲线的线性范围为62.52000μg/mL,试剂盒配备的标准品用牛血清白蛋白国家标准品标定结果为2.090 mg/mL,回收率为其标示值（2 mg/mL）的104.5%,但在测定C1-INH样品蛋白含量时,与特定蛋白检测仪的检测结果存在差异。通过对C1-INH纯品与BSA标准品的相互标定,确定了BSA为标准品检测C1-INH纯品的转换系数（1.87）。结论:PEG4000能有效去除C1-INH制备原料中的IgM,且能保持C1-INH有较高的回收率（>85%）;CM离子交换层析能对活性与非活性C1-INH进行有效分离,杂质蛋白去除率较高（>97%）;改良了BCA总蛋白测定法标准曲线的拟合方法及实验方法,完成了C1-INH纯品与BSA标准品的相互标定,确定了在C1-INH抗原浓度大于总蛋白浓度时,以BSA为标准品检测总蛋白的结果需进行换算,转换系数1.87。
时佳[5]（2020）在《两种糖基化酪蛋白消化物的免疫活性与肠屏障功能研究》文中进行了进一步梳理本研究利用酪蛋白与乳糖发生美拉德反应制备乳糖糖基化酪蛋白,用胰蛋白酶分别消化酪蛋白和乳糖糖基化酪蛋白得到酪蛋白消化物和乳糖糖基化酪蛋白消化物;同时,利用转谷氨酰胺酶催化酪蛋白与壳寡糖发生糖基化反应制备壳寡糖糖基化酪蛋白,用胰蛋白酶分别消化酪蛋白和壳寡糖糖基化酪蛋白得到酪蛋白消化物和壳寡糖糖基化酪蛋白消化物。本研究旨在剖析两种蛋白质糖基化修饰的位点,并评估两种糖基化酪蛋白消化物的免疫活性及其对小肠上皮细胞屏障功能的影响。为评估乳品加工中存在的潜在风险以及新型蛋白质配料的开发提供理论依据。主要研究结果如下:（1）两种糖基化修饰的精准糖基化位点乳糖糖基化酪蛋白消化物中乳糖含量为10.58?0.10 g/kg蛋白质;相比酪蛋白消化物,乳糖糖基化酪蛋白消化物有较低的赖氨酸、组氨酸、酪氨酸和缬氨酸。利用LC/MS-MS分析技术从乳糖糖基化酪蛋白消化物中共鉴定出5个糖肽,其糖基化位点均在赖氨酸残基,发生糖基化反应的蛋白质是Alpha-S1-casein、Beta-casein和Kappa-casein。壳寡糖糖基化酪蛋白消化物中氨基葡萄糖的导入量为5.7?0.1 g/kg蛋白质,且氨基酸含量与酪蛋白消化物基本相同。从壳寡糖糖基化酪蛋白消化物中共鉴定出3个糖肽,其糖基化位点主要在谷氨酰胺残基,发生糖基化反应的蛋白质是Alpha-S1-casein和Alpha-S2-casein。（2）两种糖基化酪蛋白消化物的体外免疫活性两种糖基化酪蛋白消化物均具有体外免疫活性。但是,与酪蛋白消化物相比,乳糖糖基化酪蛋白消化物降低Con A诱导的脾淋巴细胞刺激指数（5.1%-10.8%）、降低巨噬细胞吞噬指数（4.8%-6.5%）、降低NK细胞活性（8.2%-19.6%）,以及减少脾淋巴细胞因子（IL-2和IFN-γ）和巨噬细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的分泌;而壳寡糖糖基化酪蛋白消化物增加Con A诱导的脾淋巴细胞刺激指数（1.6%-3.9%）、增加巨噬细胞吞噬指数（4.6%-7.0%）、增加NK细胞活性（8.6%-17.3%）,以及促进脾淋巴细胞因子和巨噬细胞因子的分泌。因此,酪蛋白的酶法精准糖基化修饰提高了其消化物的体外免疫活性,而酪蛋白的美拉德反应糖基化修饰降低了其消化物的体外免疫活性。（3）两种糖基化酪蛋白消化物的体内免疫活性两种糖基化酪蛋白消化物均具有体内免疫活性。在正常BALB/c小鼠中,与灌胃生理盐水的空白组小鼠相比,各消化物处理组小鼠的血清生化指标数值均提高,免疫器官重量指数、免疫球蛋白含量、脾淋巴细胞增殖及NK细胞活性等指标也明显升高（P<0.05）。然而,酪蛋白消化物比乳糖糖基化酪蛋白消化物显示出更高的活性,而壳寡糖糖基化酪蛋白消化物比酪蛋白消化物显示出更高的活性。在环磷酰胺致免疫低下小鼠中,与生理盐水处理的正常组小鼠相比,模型组小鼠的上述指标均明显降低（P<0.05）。各消化物灌胃小鼠后,均可明显减轻环磷酰胺导致小鼠上述各项指标的下降。然而,酪蛋白消化物比乳糖糖基化酪蛋白消化物有更好的免疫提升效率,而壳寡糖糖基化酪蛋白消化物比酪蛋白消化物有更好的免疫活性。（4）两种糖基化酪蛋白消化物对正常小肠上皮细胞屏障功能的影响两种糖基化酪蛋白消化物均可以改善小肠上皮细胞屏障功能。相比酪蛋白消化物,乳糖糖基化酪蛋白消化物提高IEC-6细胞跨膜电阻值更少;壳寡糖糖基化酪蛋白消化物提高IEC-6细胞跨膜电阻值更多。各消化物处理细胞48 h后,酪蛋白消化物处理组细胞FD-4转运率从100%降低到64.0%-78.2%;乳糖糖基化酪蛋白消化物处理组细胞FD-4转运率降低到72.1%-83.4%;壳寡糖糖基化酪蛋白消化物处理组细胞FD-4转运率降低到64.1%-72.4%。而且,酪蛋白的美拉德反应糖基化修饰降低了其消化物提高抗菌活性和减少细菌移位的作用,酪蛋白的酶法精准糖基化修饰增加了其消化物提高抗菌活性和减少细菌移位的作用。此外,乳糖糖基化酪蛋白消化物处理组比酪蛋白消化物处理组有更少的细胞紧密连接蛋白质（ZO-1、occludin和claudin-1）表达,而壳寡糖糖基化酪蛋白消化物处理组比酪蛋白消化物处理组有更多的细胞紧密连接蛋白质（ZO-1、occludin和claudin-1）表达。整体上,美拉德反应糖基化修饰对蛋白质提高小肠上皮细胞屏障功能有不良的作用。酶法精准糖基化修饰对蛋白质提高小肠上皮细胞屏障功能有有益作用。（5）两种糖基化酪蛋白消化物对受损的小肠上皮细胞屏障功能的保护作用以2.5 mmol/L丙烯酰胺构建IEC-6细胞损伤模型。两种糖基化酪蛋白消化物均对受损的IEC-6细胞有保护作用。与酪蛋白消化物相比,乳糖糖基化酪蛋白消化物提高IEC-6细胞跨膜电阻值更少,而壳寡糖糖基化酪蛋白消化物提高IEC-6细胞跨膜电阻值更多。细胞被各消化物处理48 h后,酪蛋白消化物、乳糖糖基化酪蛋白消化物和壳寡糖糖基化酪蛋白消化物分别可以使FD-4转运率降低到76.6%-88.1%、79.3%-90.4%和73.0%-84.7%。该结果说明壳寡糖糖基化酪蛋白消化物作用细胞可以更有效的降低细胞膜通透性,而乳糖糖基化酪蛋白消化物作用细胞降低细胞膜通透性的效率较低。此外,乳糖糖基化酪蛋白消化物处理组比酪蛋白消化物处理组有更少的细胞紧密连接蛋白质（ZO-1、occludin和claudin-1）表达,而壳寡糖糖基化酪蛋白消化物处理组比酪蛋白消化物处理组有更多的细胞紧密连接蛋白质（ZO-1、occludin和claudin-1）表达。因此,酪蛋白的美拉德反应糖基化修饰不利于其消化物保护受损小肠上皮细胞膜的完整性,而酪蛋白的酶法精准糖基化修饰有利于其消化物保护受损小肠上皮细胞膜的完整性。综上所述,酶法精准糖基化修饰对蛋白质的免疫活性和其改善小肠上皮细胞屏障功能有有益作用;美拉德反应糖基化修饰对蛋白质的免疫活性和其改善小肠上皮细胞屏障功能有不良作用。
张哲罡[6]（2020）在《MDCK细胞基质与鸡胚基质培养对流感病毒及其疫苗影响的研究》文中认为【目的】建立纯化细胞基质流感疫苗的方法,并从分子水平、蛋白水平及糖基化水平研究MDCK细胞基质与鸡胚基质制备的H1N1病毒HA蛋白生物学特性的差异,系统性评价这些生物学特性的变化对于病毒的免疫原性和疫苗的效果的影响。【方法】采用MDCK悬浮细胞平台技术,分别培养流感病毒H1N1、H3N2、BV及BY,通过多步纯化获得较纯的抗原,制备方式包括低速离心、分子筛纯化、离子交换纯化、广谱核酸酶添加,制备成细胞基质单价H1N1疫苗及细胞基质四价流感疫苗,同时与鸡胚基质制备的单价H1N1疫苗及四价疫苗进行比较研究。进一步处理单价H1N1疫苗,将其去糖基化,制备成去糖基化的细胞基质和鸡胚基质单价H1N1疫苗。通过动物试验比较单价和四价疫苗之间免疫原性差异并对其免疫效果进行评价。同时,通过核酸测序比较两种基质培养的H1N1病毒HA核酸序列的差异;通过质谱检测比较HA蛋白氨基酸序列、糖基化位点和糖基化修饰的差异;通过动物试验比较接种后小鼠血清中细胞因子及脾脏细胞中免疫细胞分化的差异,分析上述生物学特性的差异对疫苗免疫原性的影响。在动物试验中本文还系统性比较了两种疫苗对于不同类型免疫反应的诱导能力,及剂量对于疫苗有效性的影响。【结果】纯化结果显示,该纯化策略适用于四种病毒,病毒液中的宿主蛋白去除率均高于90%,宿主DNA去除率均高于90%,血凝素回收率均高于40%,在一系列纯化后添加广谱核酸酶能进一步去除残留DNA。在生物学特性试验中,两种基质培养的流感病毒HA核酸序列一致;HA蛋白氨基酸组成与理论序列覆盖率均高于94%;鸡胚基质培养的H1N1病毒HA蛋白在N27、N39、N103、N178、N303、N497处均发现糖基化,细胞基质制备的H1N1病毒HA蛋白在N27、N39、N178、N292、N497处有糖基化,细胞基质培养的病毒在N103和N303处糖基化位点的缺失是由脱酰胺作用造成的;经过糖型分析发现,细胞基质培养的H1N1病毒HA蛋白的糖基化修饰更加复杂,多天线糖基化修饰所占比例更高,鸡胚基质培养的H1N1病毒HA蛋白中糖基修饰比较单一,主要是高甘露糖及去岩藻糖基聚糖。细胞免疫及天然免疫相关多细胞因子组动物试验结果显示,小鼠在接种细胞基质制备的流感疫苗后的6小时内,血清中MCP-1、IP-10及IL-6浓度显着升高,说明小鼠的天然免疫反应被激活,而鸡胚基质流感疫苗和去糖基化流感疫苗所引起的细胞因子变化无显着性差异,说明HA蛋白上的糖基化是诱导天然免疫的因素之一;体液免疫相关多因子组动物试验结果显示,各组小鼠在接种10天后,血清中的IL-4、IL-5及IL-10浓度无显着性差异,说明不同基质的流感疫苗及去糖基化流感疫苗在诱导体液免疫能力上差异较小;胞内细胞因子染色试验结果显示不同疫苗组之间B细胞所占比例无显着性差异,进一步说明不同基质流感疫苗在诱导体液免疫能力上差异不大,而细胞基质流感疫苗能更有效的激活CD8+T细胞的分化,且分泌TNF-α、IFN-γ及IL-2的T细胞所占比例显着高于其鸡胚基质疫苗和去糖基化流感疫苗组,说明细胞基质流感疫苗可诱导更强的细胞免疫反应,同时也说明糖基化的去除显着降低了疫苗的免疫原性及免疫效果;在体外中和试验中,小鼠在接种第二针疫苗后血清中具有中和活性的抗体显着增加,且细胞基质疫苗组小鼠的血清中和效价显着高于鸡胚基质疫苗和去糖基化疫苗组,但是在血凝抑制试验中,发现鸡胚基质疫苗组的血清保护能力略高于细胞基质流感疫苗组,这两项试验结果的矛盾可能与病毒的培养基质有关;在细胞基质流感疫苗组中比较了低、较低、中、高四个不同剂量,结果显示高剂量组诱导天然免疫、细胞免疫及体液免疫的能力显着强于中、低剂量组,说明增加剂量对细胞基质流感疫苗所产生的免疫保护结果有显着影响。【结论】本课题摸索了一套可应用于工业生产的细胞基质流感疫苗纯化策略,该方法可有效去除宿主蛋白和DNA,且在不添加广谱核酸酶的条件下宿主DNA残留量达到欧洲药典中核酸残留质量标准。在HA蛋白生物学特性的研究中发现其糖基化位点与糖基化修饰会受到培养基质的影响,在细胞基质培养的H1N1病毒中发现了一个独特的糖基化位点N292,但是该位点处于HA蛋白茎部不属于抗原表位区域,且保守性评分较低,说明并可能未处在受体结合区域,所以对于病毒的免疫原性影响仍需进一步确定;同时还发现不同基质培养的H1N1病毒HA上处于受体结合区域的几个糖基化位点的糖基化修饰存在显着差异,因HA蛋白球状头部的糖蛋白在病毒侵染细胞时起关键的识别作用,所以这些位置的糖基化差异有可能导致病毒免疫原性的变化,这说明HA蛋白上的多天线糖基化修饰和更加复杂的糖基化修饰可能是导致流感病毒免疫原性差异的重要原因。同时本研究还发现细胞基质培养的流感病毒在N103和N303处糖基化缺失是由于脱酰胺作用造成,脱酰胺作用能使蛋白质的局部疏水性发生变化,影响蛋白质的空间结构,这与培养基质的pH值、离子种类、离子强度密切相关,说明哺乳动物细胞的细胞内环境可能是造成病毒糖蛋白趋向保守的主要原因。在动物试验中发现糖基化的存在对于疫苗诱导天然免疫和细胞免疫有显着影响,说明HA蛋白的糖基化在诱导机体的天然免疫和细胞免疫时起到一定作用,这可能是因为细胞基质中流感病毒HA糖基化修饰使得病毒更容易被天然免疫和细胞免疫相关细胞识别。体液相关细胞因子的分泌情况与B细胞分化情况说明不同基质制备的流感疫苗的诱导体液免疫能力较为一致,但是动物试验中的体外中和试验结果与血凝抑制试验结果存在矛盾,产生这一现象的原因可能是由于体外中和试验中所用的细胞就是培养流感病毒的MDCK细胞,所以小鼠血清中抗体特异性更强,导致血清的中和效价更高,而血凝抑制所用的材料为鸡血红细胞,在结合鸡胚基质培养的流感病毒时能力更强,导致血凝实验中鸡胚基质疫苗组结果更好,同时上述两项试验结果也说明在检定两种基质流感疫苗时应区分别建立特异性检定方法才能获得更准确的检定结果。
王闽佳[7]（2020）在《烘烤对花生致敏性的影响及其机理研究》文中提出花生过敏引起的致死率占了食物过敏致死病例的59%,是人类健康的重大威胁之一。近年来研究显示欧美人群的花生过敏患病率较高,可能与他们偏爱食用由烘烤花生原料制成的花生酱有关。花生的不同加工条件如烘烤,可能改变了花生过敏原结构,并可能对花生的致敏性产生影响。本文以烘烤花生为材料,分析了烘烤温度和烘烤时长对花生蛋白含量和糖基化程度的改变;应用BALB/c小鼠模型评价了不同烘烤处理对花生致敏性的影响。在此基础上,纯化得到花生主要过敏原之一的Ara h 3蛋白,通过Caco-2细胞模型和树突状细胞模型,研究了在过敏反应的致敏阶段,烘烤对Ara h 3在肠道免疫系统中的作用,揭示了烘烤花生Ara h 3的增敏机理。主要研究内容和结论如下:1不同烘烤条件对花生蛋白含量、糖基化和致敏性的影响分别将花生仁在110℃、130℃、150℃或170℃下烘烤20 min,或置于150℃的烤箱中烘烤10 min、20 min、30 min和40 min,烘烤后提取花生蛋白,检测烘烤花生蛋白的浓度及糖基化水平。随花生的烘烤温度升高或烘烤时长增加,蛋白浓度逐渐降低;与生花生蛋白相比,无论是不同温度烘烤花生20 min,还是150℃烘烤花生不同时长,烘烤后花生蛋白中游离氨基含量显着降低,结合糖含量上升,伴有果糖胺和小分子荧光产物产生,表明花生在不同烘烤条件下,蛋白均发生了不同程度的糖基化反应。将不同烘烤花生研磨成匀浆,通过灌胃致敏BALB/c小鼠。结果显示,与生花生致敏组小鼠相比,烘烤花生致敏组小鼠的肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒程度加深,空肠和肺组织炎性浸润和充血现象严重,小肠和肺组织中TSLP基因表达水平上调,小鼠血清中Th2型细胞因子（IL-4、IL-5、IL-13）含量升高,伴随着特异性抗体（Ig E、Ig G）和组胺含量的升高,并且烘烤花生蛋白与花生特异性Ig E抗体的结合力升高,这些结果都表明,随着花生烘烤温度升高或烘烤时长增加,其致敏性逐渐增强。2花生Ara h 3的纯化及烘烤对Ara h 3结构、糖基化和致敏性的影响通过阴离子交换色谱法分别纯化得到生花生Ara h 3蛋白（命名为Ara h 3-Raw）,烘烤花生Ara h 3蛋白（命名为Ara h 3-Roasted,150℃烘烤20 min）。微观结构检测结果表明,与Ara h 3-Raw相比,Ara h 3-Roasted二级结构由有序变得无序,疏水性减小,有聚集发生。糖基化水平结果显示,与Ara h 3-Raw相比,Ara h 3-Roasted美拉德反应达到晚期。竞争抑制ELISA结果表明,烘烤处理增强了Ara h 3与花生特异性Ig E和Ig G抗体的结合能力,这表明烘烤处理增强了Ara h 3的潜在致敏性。3烘烤花生Ara h 3致敏性增强的机理研究用Caco-2细胞单层模型和树突状细胞模型模拟了Ara h 3-Roasted对胃肠道免疫系统的影响。实验结果表明,Ara h 3-Roasted降低Caco-2细胞活力,抑制细胞增殖,促使ROS含量上升,氧化应激失衡激活NF-κB信号通路,导致促炎因子IL-6、IL-8和MCP-1含量上升;Ara h 3-Roasted降低Caco-2细胞单层跨膜电阻值,下调紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和JAM-1的基因表达,破坏Caco-2细胞上ZO-1的分布和Caco-2细胞单层屏障的完整性,最终导致Caco-2细胞单层对Ara h 3-Roasted蛋白转运增强,促进了胃肠道对Ara h 3-Roasted的吸收;Ara h 3-Roasted上调树突细胞清道夫受体成分LRP-1的基因表达,引起树突状细胞对Ara h 3-Roasted的摄取能力增强,上调Th2型炎症因子IL-10的基因表达,下调Th1型细胞因子IL-12的基因表达,进而引发更严重的Th2型过敏反应。
郭艳丽[8]（2020）在《马里苷单克隆抗体的制备以及抗糖尿病肾病机制研究》文中指出目的:糖尿病肾病目前是世界各国慢性肾脏疾病和终末期肾病的主要病因,马里苷为两色金鸡菊抗糖尿病肾病的有效成分之一,但作用机制尚不明确。本文通过制备马里苷单克隆抗体,建立间接竞争ELISA方法,用于药材中马里苷定量检测,并探讨马里苷对糖尿病肾病保护作用以及机制。方法:1.马里苷单抗制备:采用高碘酸钠法和曼尼希法制备人工抗原,PEG法诱导小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,筛选出能特异性产生马里苷的杂交瘤细胞株,进行亚克隆。腹水法大量制备抗体后,饱和硫酸铵法纯化抗体。建立间接竞争ELISA方法用于两色金鸡菊提取物中马里苷的定量检测,并与高效液相方法做比较。2.马里苷体外吸收机制研究:建立MDCK单层细胞模型,采用UPLC-MS/MS对马里苷进行含量测定,考察马里苷吸收和外排转运特性,并考察SGLTs的非选择性抑制剂（根皮苷）和GLUT2抑制剂（根皮素）对马里苷在MDCK细胞模型跨膜转运的影响。3.体外实验:采用Western-blot以及RT-q PCR检测马里苷对高糖诱导HK-2细胞SGLT2表达影响,检测AMPK/ACC信号通路以及炎症和纤维化相关蛋白表达;进一步采用慢病毒技术过表达SGLT2蛋白,探讨马里苷对SGLT2表达的影响。4.体内实验:采用db/db糖尿病小鼠,共分为四组:db/m组、db/db组、db/db恩格列净组（10mg/kg）和db/db马里苷组（50mg/kg）,连续给药12周,测定血清生化指标以及肝肾功能指标。PAS染色、Masson染色和透射电镜观察肾组织病理学变化。Western-blot和免疫组化检测肾组织SGLT2的表达,AMPK/ACC/PGC-1信号通路探讨马里苷对肾脏保护作用机制。结果:1.马里苷单抗制备:高碘酸钠法和曼尼希法制备马里苷人工抗原,薄层鉴定结果均显示合成成功,但免疫Balb/c小鼠,只有曼尼希法合成的人工抗原在小鼠体内产生马里苷特异性抗体,小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合后,经亚克隆得到马里苷单克隆细胞株4B11。建立间接竞争ELISA方法用于马里苷定量检测,结果表明:马里苷在156.25-5000 ng/m L范围内成线性（R2=0.991）,且精密度与加样回收率均符合要求。对于两色金鸡菊提取物中马里苷定量检测,该间接竞争ELISA方法与HPLC方法高度吻合,并且发现杭菊和贡菊提取物均未检测出马里苷。2.马里苷在MDCK单层细胞模型吸收和外排转运的Papp均在在1-4×10-6cm·s-1,属于中等吸收化合物,除了被动转运之外,主动转运也参与其跨膜转运。SGLTs抑制剂根皮苷干预后,马里苷转运量显着降低,并具有显着性差异;GLUT2抑制剂根皮素无明显影响。3.体外实验:马里苷抑制正常HK-2细胞SGLT2蛋白表达,抑制葡萄糖摄取。在高糖干预HK-2细胞模型上,马里苷和根皮苷均能明显抑制SGLT2蛋白和m RNA表达增高;达格列净对正常细胞和高糖干预HK-2细胞的SGLT2蛋白表达无明显影响,但其可以逆转高糖引起SGLT2 m RNA表达增高;达格列净、根皮苷和马里苷干预后均能激活高糖干预HK-2细胞p-AMPK/p-ACC蛋白,且达格列净干预组对AMPK,ACC m RNA表达升高更为显着;根皮苷和马里苷干预能抑制高糖诱导的细胞外基质蛋白COL1和FN以及促炎因子MCP-1和IL-6表达上调。HK-2细胞过表达SGLT2后,马里苷干预能显着抑制SGLT2表达增高。4.体内实验:马里苷和恩格列净干预对db/db小鼠的体重和肾重无明显影响,但两者均可明显降低空腹血糖,改善胰岛素抵抗。除了降糖作用外,两者均能显着降低糖尿病小鼠血清甘油三酯、胆固醇和低密度脂蛋白,并且增加血清脂联素含量改善脂代谢紊乱;两者均能逆转糖尿病引起的血清中促炎因子IL-6和MCP-1的增高,但对机体总的抗氧化能力没有影响。马里苷和恩格列净对糖尿病小鼠的肝功能无明显的影响,但是能显着改善糖尿病引起肾功能减退;PAS、Masson染色结果表明,马里苷和恩格列净干预均能显着改善糖尿病引起的肾小球和肾小管基底膜增厚,肾小球硬化和肾小管纤维化。糖尿病肾病情况下,肾小管SGLT2表达显着增高,恩格列净和马里苷均能显着抑制SGLT2表达增高;且两者均能通过激活p-AMPK/p-ACC/PGC-1通路,抑制SREBP-1表达改善糖尿病引起的肾脏脂质异位沉积。此外,两者均能在不同程度上缓解糖尿病引起的肾脏炎症和纤维化。结论:1.基于马里苷单克隆抗体建立的间接竞争ELISA方法可以用于药材中马里苷定量检测,且与高效液相有很好的一致性。2.马里苷在MDCK单层细胞模型以原型吸收,属于中等吸收化合物,SGLTs可能介导马里苷在MDCK单层细胞上的跨膜转运。3.马里苷能够抑制正常HK-2细胞SGLT2蛋白表达,抑制葡萄糖摄取;且马里苷能逆转高糖干预和SGLT2过表达引起SGLT2表达增高,同时通过激活p-AMPK/p-ACC,抑制纤维化和炎症而缓解高糖损伤。4.马里苷能够显着抑制db/db糖尿病小鼠肾脏SGLT2表达增高。同时,其通过激活p-AMPK/p-ACC/PGC-1通路,抑制SREBP-1蛋白表达减轻肾脏脂质异位堆积,减轻脂毒性。此外,马里苷通过抑制纤维化和炎症相关蛋白而发挥保护作用。
陈卫军[9]（2020）在《基于乳清分离蛋白的载体材料构建及对功能因子的稳态作用研究》文中研究表明乳清分离蛋白（WPI）常作为载体材料构建传递体系来包埋和保护食品功能因子,以提高其理化稳定性和生物利用率。但是,以蛋白质构建的传递体系对环境条件（p H、高温和离子浓度等）较敏感,限制了其在食品工业中的广泛应用。以改性蛋白质作为载体材料是克服此不足的一种有效方法。多糖和多酚的共价接枝能够赋予蛋白质新的功能性质,对构建高理化稳定性的传递体系具有重要意义。本研究以WPI、阿拉伯胶（GA）和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）为研究对象,采用不同方法制备二元或三元共价复合物,表征其结构和理化特性,并将这些共价复合物用于构建纳米复合物和纳米乳液传递体系,评价其对食品功能因子的稳态作用。主要研究内容和结论如下:（1）以干法糖基化制备WPI-GA共价复合物,发现反应1、3、5和7 d时共价复合物的接枝度分别为28.14%、44.98%、49.50%和51.20%,且接枝度越高褐变越严重。GA的共价连接使WPI二级结构中α-螺旋含量降低,无规卷曲含量增加,蛋白质荧光强度和表面疏水性降低。糖基化能改善WPI的热稳定性、溶解性和乳化性,但共价复合物的溶解性和乳化性分别在反应1和5 d时达到最佳,说明具备最佳功能性质的糖基化WPI的接枝度不一定是可获得的最高水平。（2）以超声辅助制备WPI-GA共价复合物,发现超声处理能明显提高WPI的糖基化速率,在优化条件下（超声温度70 oC,超声功率500 W,初始p H 11.0,蛋白质浓度10.0 mg/m L和蛋白质-多糖质量比1:2）处理80 min即可获得同干法反应1 d相当的接枝度,且复合物褐变度较低。同干法制备的共价复合物相比,超声辅助制备的共价复合物分子量较小,二级结构中α-螺旋含量更低而无规卷曲含量更高,内源荧光强度和表面疏水性更高,空间结构更松散。结构上的差异使前者热稳定性和乳化稳定性较好,后者溶解性和乳化活性较好。（3）以WPI-GA共价复合物构建负载EGCG的纳米复合物传递体系,发现超声辅助糖基化会增强WPI同EGCG的结合能力,而干法糖基化则相反,因而超声辅助制备的共价复合物对EGCG负载率更高。基于多糖链的空间位阻作用,糖基化对EGCG诱导的蛋白质聚集有明显抑制作用,能够提高纳米复合物的多酚载量。同蛋白质形成纳米复合物对EGCG及其抗氧化活性均具有保护作用,而糖基化能增强这种作用,尤其是超声辅助糖基化。糖基化可以增强纳米复合物中EGCG的生物有效性,但不同方法糖基化对EGCG生物有效性的影响没有显着差异（p>0.05）。总体而言,超声辅助制备的WPI-GA共价复合物更适合构建蛋白质-多酚纳米复合物传递体系。（4）以WPI-GA共价复合物稳定β-胡萝卜素纳米乳液,发现同WPI和WPI-GA混合物稳定的纳米乳液相比,共价复合物稳定的纳米乳液冻融稳定性、盐离子稳定性、热稳定性和酸碱稳定性及乳液中β-胡萝卜素的紫外光照稳定性和储藏稳定性更好。GA的共价连接可以提高WPI稳定的纳米乳液中β-胡萝卜素的生物有效性,但超声辅助制备的共价复合物稳定的纳米乳液中β-胡萝卜素的生物有效性低于物理混合物稳定的纳米乳液。同超声辅助制备的共价复合物稳定的纳米乳液相比,干法制备的共价复合物稳定的纳米乳液热稳定性更好,且β-胡萝卜素的生物有效性更高,因而更适合构建纳米乳液传递体系。（5）以碱法、自由基法和酶法制备WPI-EGCG共价复合物,并将其用于稳定β-胡萝卜素纳米乳液。发现酶法诱导接枝效率最高,其次为碱法。EGCG的共价接枝使WPI二级结构中α-螺旋含量减少,无规卷曲含量增加,蛋白分子荧光强度降低。碱法和酶法诱导的EGCG共价接枝会使WPI表面疏水性降低、热稳定性提高,而自由基法则相反。共价复合物的抗氧化活性明显增强,且同EGCG接枝量呈正比。同WPI相比,共价复合物作为乳化剂可以明显抑制乳液中β-胡萝卜素在紫外光照和储藏过程中的降解,这种抑制作用也同EGCG接枝量呈正相关。（6）在WPI-EGCG二元共价复合物基础上,采用干法美拉德反应制备WPI-EGCG-GA三元共价复合物,并将其用于稳定β-胡萝卜素纳米乳液。GA的共价连接使二元复合物热稳定性和抗氧化活性增强。同WPI、WPI-EGCG二元共价复合物和WPI-EGCG-GA三元混合物稳定的纳米乳液相比,WPI-EGCG-GA三元共价复合物稳定的纳米乳液显示更好的冻融稳定性、盐离子稳定性,热稳定性和酸碱稳定性,乳液中β-胡萝卜素的紫外光照和热稳定性明显增强,乳液中β-胡萝卜素的生物有效性显着提高。
刘亚平[10]（2019）在《藏鸡种蛋氧化应激响应蛋白质的筛选及其PIT54对血管生成机制的研究》文中研究指明近些年来,大量研究探究了鸡蛋不同部位的蛋白质组及其生物活性。但是,不同生长环境对于鸡蛋蛋白质组及生物活性的影响尚不清楚。为挖掘藏鸡蛋特有的功能蛋白质,本研究以两种海拔鸡种蛋为研究对象,分别选取青藏高原的土着品种藏鸡种蛋和在世界范围内广泛饲养的人工选育品种白来航鸡种蛋,对蛋清和蛋黄蛋白质组及其生物功能进行了详细的分析,进而通过构建人工注释的鸡蛋蛋清和蛋黄蛋白质数据集,筛选出抗氧化相关候选蛋白质PIT54,并围绕着两种海拔高度鸡种蛋PIT54的DNA序列的单核苷酸多态性位点、蛋白质提取优化、质谱分析、抗氧化活性和对血管生成的影响及其机制初步探究等方面开展了一系列研究工作。主要研究结果如下:（1）利用非标记蛋白质组学对藏鸡种蛋清蛋白质（TEW）和白来航种蛋蛋清蛋白质（CEW）进行了比较研究,以鉴定差异蛋清蛋白质及其生物活性。一共鉴定出176种蛋白质。其中,14种表达量差异显着（倍数>1.5且P<0.05）的蛋白质,主要参与了脂质转运、免疫防御、生长发育和抗氧化过程;通过体外实验和Caco-2细胞的抗氧化实验证实了CEW和TEW之间抗氧化应激活性的差异;前列腺素-H2D-异构酶前体和谷胱甘肽过氧化物酶被认为是与差异抗氧化活性相关的候选蛋白质。（2）通过非标记定量技术比较了藏鸡种蛋蛋黄蛋白质（TEY）和白来航鸡种蛋蛋黄蛋白质（CEY）的蛋白质表达图谱,一共鉴定出135种蛋白质,其中19种蛋白质的表达量在两组样本间存在显着差异（倍数>1.5且P<0.05）;差异表达的蛋白质主要与氧化应激、免疫、能量代谢以及组织发育等过程相关;为了进一步验证抗氧化能力的差异,通过体外实验和对H2O2诱导氧化应激的Caco-2细胞的保护作用实验比较了CEY和TEY的抗氧化应激活性差异。TEY和CEY均具有抗氧化活性,但前者表现出的抗氧化应激能力更强（P<0.05）,该结果可能与TEY中的抗氧化活性相关蛋白（谷胱甘肽过氧化物酶3和PIT54）的表达量差异有关。（3）由于蛋白质表达的动态性,本研究中鉴定的蛋白质种类与文献报道种类有所差异。为更加广泛地筛选抗氧化蛋白质进行后续实验,通过构建人工注释的鸡蛋蛋清和蛋黄蛋白质的非冗余数据集,筛选出了鸡蛋中抗氧化蛋白质合集,以具有抗氧化应激作用和研究较少为基本原则,初步选择了PIT54作为候选的抗氧化活性相关蛋白。PIT54还具有促进血管生成以及免疫调节等生物活性。进一步通过生物信息学对PIT54的结构和功能进行分析发现,分子中含有4个重复的SRCR结构域和6个保守的半胱氨酸残基,具有清道夫受体活性,定位于细胞膜,主要与脂质运输、细胞激活以及含氧化合物响应过程相关,说明其的确与低氧氧化应激过程相关。（4）根据PIT54可以与血红蛋白结合的特性,将鸡血红蛋白通过CNBr偶联到活化的Sepharose 4B上,制备吸附血红蛋白的亲和柱,用来纯化PIT54。研究了不同缓冲液体系（Tris-HCl,p H 8.1和硼酸盐缓冲液,p H 8.1）对于PIT54分离的影响,建立了从蛋黄中分离纯化PIT54的方法,蛋黄经正己烷脱油后获得粗蛋白,依次经过DEAE阴离子交换层析和吸附血红蛋白的亲和层析柱亲和层析两步分离法,便可以快速高效地获得PIT54蛋白质,并保持了蛋白质活性,该方法操作简单。相比于C-PIT54,T-PIT54具有更强的与Hb结合的能力（P<0.05）和抑制LDL脂质氧化反应的能力（P<0.05）。质谱分析发现PIT54分子中一共检测到3个N-糖基化位点（85N、157N和485N）。其中,157N仅在C-PIT54中检测到,另外两个位于SRCR结构域的糖酸化位点在T-PIT54分子中的糖基化程度显着高于C-PIT54（P<0.05）。C-PIT54和T-PIT54分子中都只检测到了一个磷酸化位点411Ser,位于SRCR结构域N端,T-PIT54的磷酸化程度显着低于C-PIT54（P<0.05）。（5）为了研究两种海拔高度鸡种蛋来源的PIT54对常氧和低氧孵化的鸡胚血管生成的影响,需要模拟高原低氧环境。首先,本研究在原有孵化箱的基础上,通过外加氮气模拟低氧环境;利用单片机优化了氧气、二氧化碳、温度、湿度及其翻蛋控制系统,同时完善了孵化箱的密闭性;实现了准确、稳定的模拟不同含氧量下的鸡胚孵化过程。该设备操作简单,成本低,实用性强。利用该孵化箱模拟低氧环境进行后续实验。之后,以不同孵化时期的常氧和低氧孵化的白来航鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）为研究对象,以血管覆盖度和血管直径的分布情况为指标,筛选出D4、D8和D12为给药的时间点;然后,比较分析了T-PIT54和C-PIT54处理对低氧和常氧环境下的藏鸡和白来航鸡胚CAM血管发育情况的影响。最终发现了PIT54可以作为促血管生成因子,具有促进血管生成的作用,T-PIT54具有更强的促进血管生成的能力（P<0.05）,且作用范围广泛;C-PIT54对血管生成的促进作用具有种间差异性;T-PIT54和C-PIT54对于第8天的鸡胚的影响最大。因此,选择了两种给药处理的NC8、HC8和HT8组进行后续机制探究;（6）筛选出特异性肽段CTVNKNLEETETS制备PIT54抗体,经检验抗体效果良好。利用该抗体通过WB和免疫组织化学分析PIT54在鸡胚组织中的特异性表达,结果发现PIT54蛋白质在鸡胚的血液和肺泡中大量表达,在心脏、脑和血管中少量表达,在系带和肝脏中未检测到PIT54的特异性表达。通过免疫分子印迹分别考察了T-PIT54和C-PIT54处理后,CAM中的VEGFR2上下游相关蛋白的表达水平及磷酸化情况。发现低氧环境中,C-PIT54和T-PIT54可以通过显着增加上游的HIF-1α的表达量,刺激血管新生;增强VEGFR2/Src信号分子机制提高内皮细胞的通透性,有助于出芽和迁移;通过影响PI3K/Akt信号分子机制和提升ERK的磷酸化程度促进细胞增殖;增加p38单个蛋白质的磷酸化水平抑制细胞凋亡。这些都证明了C-PIT54和T-PIT54可以促进血管生成,提高低氧环境的适应性。但是,这两种外源添加的PIT54对低氧孵化鸡胚血管生成的促进作用具有种间差异性。两者在常氧白来航鸡胚中表现出与低氧环境相反的作用,可以避免血管内皮细胞的过度增殖。（7）通过对藏鸡源和白来航鸡源的PIT54 protein基因的DNA序列进行扩增测序发现,PIT54 protein基因全长5186 bp,包括8个外显子和7个内含子。同源比对结果显示,测序获得的T-PIT54与C-PIT54的内含子序列差异较大,但是,CDS序列保守性较高（99%identify）,表明了藏鸡源和白来航鸡源的PIT54 protein具有遗传稳定性。与C-PIT54相比,T-PIT54的DNA序列中存在着5个突变和5个插入片段;根据预测获得T-PIT54与C-PIT54蛋白质的氨基酸序列,生物信息学分析发现,T-PIT54的α-螺旋,结构更加紧密。两种蛋白质分子中都存在12个结合位点,但是部分位点具有种间特异性。这些序列与结构的差异可能是造成T-PIT54与C-PIT54抗氧化活性和促进血管生成活性差异的主要原因。
二、糖基化白蛋白液中糖含量的不同定量方法比较（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、糖基化白蛋白液中糖含量的不同定量方法比较（论文提纲范文）
（1）长效化胰高血糖素样肽-1类似物设计、合成及降糖活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 二型糖尿病 |
| 1.1.1 二型糖尿病的定义 |
| 1.1.2 二型糖尿病的发病机制 |
| 1.1.3 二型糖尿病的流行病学 |
| 1.2 GLP-1 多肽药物 |
| 1.2.1 GLP-1和Exendin-4 简介 |
| 1.2.2 GLP-1和Exendin-4 的药理学作用 |
| 1.2.3 GLP-1和Exendin-4 构效关系研究 |
| 1.2.4 GLP-1和Exendin-4在T2DM治疗中的优劣势 |
| 1.3 长效GLP-1 RAs的研究进展 |
| 1.3.1 氨基酸序列改造以及非天然氨基酸的引入 |
| 1.3.2 糖基化修饰 |
| 1.3.3 PEG化修饰 |
| 1.3.4 脂肪酸修饰 |
| 1.3.5 白蛋白修饰 |
| 1.3.6 Fc融合 |
| 1.3.7 缓释给药系统 |
| 1.3.8 口服制剂开发 |
| 1.4 内源性抗体 |
| 1.4.1 内源性抗体简介 |
| 1.4.2 内源性抗体应用 |
| 1.5 本论文的立题依据、研究意义和主要研究内容 |
| 1.5.1 立题依据与研究意义 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 第二章 葡聚糖-Ex4 偶联物的设计、合成和生物活性评价 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株和细胞株 |
| 2.2.2 原料与试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 主要试剂配制 |
| 2.2.5 Ex4 及其类似物的合成 |
| 2.2.6 葡聚糖-Ex4 偶联物的合成 |
| 2.2.7 葡聚糖-Ex4 偶联物的表征 |
| 2.2.8 胞内c AMP含量测定实验 |
| 2.2.9 STZ联合高脂饲料建立二型糖尿病小鼠模型 |
| 2.2.10 腹腔糖耐量实验 |
| 2.2.11 长效降血糖实验 |
| 2.2.12 统计学分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 Ex4、Ex4-12K*、Ex4-27K*以及Ex4-12K*-27K*的制备和表征 |
| 2.3.2 葡聚糖-Ex4 偶联物的制备和表征 |
| 2.3.3 葡聚糖-Ex4 偶联物体外GLP-1R结合能力评价 |
| 2.3.4 葡聚糖-Ex4 偶联物体内急性降血糖能力评价 |
| 2.3.5 葡聚糖-Ex4 偶联物体内长效降血糖能力评价 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 Ex4-DNP偶联物的设计、合成和生物活性评价 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株和细胞株 |
| 3.2.2 原料与试剂 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.2.4 主要试剂配制 |
| 3.2.5 带有Srt A识别信号肽的Ex4 类似物的合成 |
| 3.2.6 Srt A介导的Ex4 类似物与DNP衍生物的偶联反应 |
| 3.2.7 胞内c AMP含量测定实验 |
| 3.2.8 药代动力学实验 |
| 3.2.9 腹腔糖耐量实验 |
| 3.2.10 预免疫前后长效降糖实验 |
| 3.2.11 长期实验 |
| 3.2.12 组织学分析 |
| 3.2.13 统计学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 C端带有Srt A酶识别信号肽的Ex4 类似物的制备和表征 |
| 3.3.2 Ex4-DNP偶联物的制备和表征 |
| 3.3.3 Ex4-DNP偶联物体外GLP-1R结合能力评价 |
| 3.3.4 Ex4-DNP偶联物体内半衰期评价 |
| 3.3.5 Ex4-DNP偶联物体内急性降血糖能力评价 |
| 3.3.6 Ex4-DNP偶联物体内长效降血糖能力评价 |
| 3.3.7 长期治疗理化指标和安全性初步评价 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 Ex4-Lipid-Rha偶联物的设计、合成和生物活性评价 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株和细胞株 |
| 4.2.2 原料与试剂 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.2.4 主要试剂配制 |
| 4.2.5 带有Srt A识别信号肽的Ex4 类似物的合成 |
| 4.2.6 Srt A介导的Ex4 类似物与Lipid-Rha衍生物的偶联反应 |
| 4.2.7 胞内c AMP含量测定实验 |
| 4.2.8 腹腔糖耐量实验 |
| 4.2.9 预免疫前后长效降糖实验 |
| 4.2.10 统计学分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 C端带有Srt A识别信号肽Ex4 类似物的制备和表征 |
| 4.3.2 Ex4-Lipid-Rha偶联物的制备和表征 |
| 4.3.3 Ex4-Lipid-Rha偶联物体外GLP-1R结合能力评价 |
| 4.3.4 Ex4-Lipid-Rha偶联物体内急性降血糖能力评价 |
| 4.3.5 Ex4-Lipid-Rha偶联物体内长效降血糖能力评价 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 新一代GLP-1 RA索玛鲁肽半合成方法开发 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株和细胞株 |
| 5.2.2 原料与试剂 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.2.4 主要试剂配制 |
| 5.2.5 水杨醛二甲缩醛(1)的合成 |
| 5.2.6 四肽水杨醛酯(NH_2-HAibEG-SAL,2)的合成 |
| 5.2.7 通过苏氨酸结扎反应进行Aib~8,Arg~(34)GLP-1(7-37)(4)的合成 |
| 5.2.8 Aib~8,Arg~(34)GLP-1(7-37)(4)的二级质谱分析 |
| 5.2.9 侧链活化酯5 的制备 |
| 5.2.10 肽骨架Aib~8,Arg~(34)GLP-1(7-37)的酰化反应 |
| 5.2.11 化合物6 的二级质谱分析 |
| 5.2.12 化合物7 的合成及纯化 |
| 5.2.13 化合物7 的体外生物活性测定 |
| 5.2.14 统计学分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 四肽水杨醛酯(NH_2-HAibEG-SAL,2)的合成 |
| 5.3.2 通过STL连接反应进行Aib~8,Arg~(34)GLP-1(7-37)(4)的合成 |
| 5.3.3 酰化产物6 的合成与制备 |
| 5.3.4 酰化产物6 的脱保护反应 |
| 5.3.5 化合物7 的生物活性测定 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ 附图 |
| 附录 Ⅱ 作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（2）质谱鉴定中药阿胶的胶原蛋白和糖胺聚糖及研究糖胺聚糖与趋化因子的相互作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 胶原蛋白及其降解物 |
| 1.1.1 胶原蛋白类型与分子结构 |
| 1.1.2 胶原蛋白降解物 |
| 1.1.3 胶原蛋白的传统鉴定方法 |
| 1.2 糖胺聚糖的种类及功能 |
| 1.2.1 肝素及硫酸乙酰肝素 |
| 1.2.2 硫酸软骨素和硫酸皮肤素 |
| 1.2.3 透明质酸 |
| 1.2.4 硫酸角质素 |
| 1.3 趋化因子的结构及生理作用 |
| 1.3.1 CCL5的结构特点 |
| 1.3.2 CCL5的生理作用 |
| 1.4 糖基化修饰的种类及功能 |
| 1.4.1 N-连接糖基化 |
| 1.4.2 O-GalNAc糖基化 |
| 1.4.3 O-GlcNAc糖基化 |
| 1.4.4 磷酸化糖基修饰 |
| 1.4.5 C-甘露糖基化 |
| 1.4.6 糖基化磷脂酰肌醇锚定 |
| 1.5 现代质谱分析技术 |
| 1.5.1 生物质谱仪 |
| 1.5.2 质谱的碎裂方式 |
| 1.6 蛋白质与糖胺聚糖的质谱分析策略 |
| 1.6.1 蛋白质的质谱分析策略 |
| 1.6.2 糖胺聚糖的质谱分析策略 |
| 1.7 糖胺聚糖与蛋白的相互作用 |
| 1.8 论文大纲 |
| 第二章 阿胶中胶原蛋白成分的鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 试剂与耗材 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 色谱柱 |
| 2.2.4 缓冲液及流动相的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 动物皮样处理 |
| 2.3.2 胶样产品处理 |
| 2.3.3 蛋白酶解 |
| 2.3.4 NanoLC-MS/MS分析 |
| 2.3.5 生物信息学分析 |
| 2.3.6 数据库搜索 |
| 2.3.7 LC-MRM-MS/MS分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 鸟枪法蛋白组学 |
| 2.4.2 生物信息学 |
| 2.4.3 挑选每个物种的特征肽 |
| 2.4.4 特征肽的MRM定量方法研究 |
| 2.4.5 掺假阿胶产品的检测 |
| 2.4.6 掺假杂交动物皮的阿胶的鉴定 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 阿胶制作中糖胺聚糖的变化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试剂与耗材 |
| 3.2.1 试剂与耗材 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 色谱柱 |
| 3.2.4 缓冲液及流动相的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 糖胺聚糖的提取 |
| 3.3.2 糖胺聚糖的酶解及AMAC标记 |
| 3.3.3 LC-MRM-MS/MS分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 糖胺聚糖的结构表征和含量测定 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 人血浆中天然CCL5的鉴定 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 药品与试剂 |
| 4.2.1 试剂与耗材 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 色谱柱 |
| 4.2.4 缓冲液及流动相的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 CCL5多抗偶联琼脂糖珠的制备 |
| 4.3.2 CCL5的纯化 |
| 4.3.3 野豌豆凝集素亲和柱的制备 |
| 4.3.4 CCL5的糖肽富集 |
| 4.3.5 蛋白酶解 |
| 4.3.6 质谱分析 |
| 4.3.7 数据库搜索 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 血浆制备 |
| 4.4.2 天然CCL5的存在形式 |
| 4.4.3 CCL5的糖基化形式 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 CCL5异型体混合物的定性及定量研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 药品与试剂 |
| 5.2.1 试剂与耗材 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 色谱柱 |
| 5.2.4 缓冲液及流动相的配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 CCL5异型体混合物的酶解 |
| 5.3.2 CCL5异型体混合物的质谱分析 |
| 5.3.3 CCL5混合物的定量方法摸索 |
| 5.3.4 数据处理 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 CCL5糖基化异型体的合成 |
| 5.4.2 CCL5碎裂方式选择 |
| 5.4.3 HCD和ETD鉴定CCL5 |
| 5.4.4 CCL5定量方法应用 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 CCL5与肝素相互作用研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 药品与试剂 |
| 6.2.1 试剂与耗材 |
| 6.2.2 主要仪器 |
| 6.2.3 色谱柱 |
| 6.2.4 缓冲液及流动相的配制 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 BLI测定 |
| 6.3.2 分子对接模拟 |
| 6.3.3 CCL5混合物过肝素亲和柱 |
| 6.3.4 洗脱样品的定量质谱分析 |
| 6.3.5 数据处理 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 CCL5个体与肝素的相互作用 |
| 6.4.2 分子对接模拟 |
| 6.4.3 CCL5混合物与肝素的相互作用 |
| 6.5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文及申请的专利 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）海带低分子量褐藻多糖硫酸酯对糖尿病肾病的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 糖尿病肾病 |
| 1.2 糖尿病肾病药物治疗现状 |
| 1.3 褐藻多糖硫酸酯特性 |
| 1.4 褐藻多糖硫酸酯生物活性 |
| 1.4.1 抗凝血作用 |
| 1.4.2 抗炎症作用 |
| 1.4.3 抗氧化作用 |
| 1.5 褐藻多糖硫酸酯对糖尿病肾病治疗研究进展 |
| 1.6 表面等离子体共振技术介绍 |
| 1.7 肠道菌群 |
| 1.7.1 肠道菌群与糖尿病 |
| 1.7.2 肠道菌群与肾病 |
| 1.7.3 肠道菌群与多糖 |
| 1.8 研究目的及意义 |
| 1.9 技术路线 |
| 第2章 LMWF抑制肾小球系膜细胞病变的作用机理研究 |
| 前言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验试剂盒 |
| 2.1.5 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 HRMCs在含不同浓度FBS培养基中生长状况 |
| 2.2.2 LMWF抑制HRMCs异常增殖 |
| 2.2.3 LMWF抑制HRMCs肥大 |
| 2.2.4 LMWF电负性变化及中和条件选择 |
| 2.2.5 LMWF降低内毒素含量 |
| 2.2.6 LMWF降低乳酸脱氢酶活性 |
| 2.2.7 蛋白质组学分析 |
| 2.2.8 差异表达蛋白验证 |
| 2.2.9 FN在 HRMCs中分布情况 |
| 2.2.10 LMWF在 HRMCs中分布情况 |
| 2.2.11 LMWF与 FN共定位 |
| 2.2.12 SPR检测LMWF与 FN特异性结合 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 LMWF改善AGEs引起的HRMCs异常生长 |
| 2.3.2 PS中和LMWF电负性 |
| 2.3.3 LMWF降低AGEs带来的细胞损伤 |
| 2.3.4 聚焦细胞外基质-受体相互作用及FN |
| 2.3.5 LMWF与 FN相互作用 |
| 2.3.6 PS促进LMWF改善HRMCs损伤 |
| 第3章 LMWF对大鼠糖尿病肾病的治疗效果研究 |
| 前言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验材料 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 实验试剂 |
| 3.1.5 实验试剂盒 |
| 3.1.6 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 生长相关指标 |
| 3.2.2 血清生化指标 |
| 3.2.3 葡萄糖耐量 |
| 3.2.4 胰岛素耐量 |
| 3.2.5 肾脏功能相关指标 |
| 3.2.6 肾脏形态学观察 |
| 3.2.7 肾脏炎症因子 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 LMWF未降低DN大鼠血糖水平 |
| 3.3.2 LMWF改善糖尿病大鼠肾脏损伤 |
| 3.3.3 LMWF抑制肾脏炎症细胞因子上调 |
| 3.3.4 LMWF缓解DN与肠道菌群相关 |
| 第4章 LMWF对 DN大鼠肠道功能及肠道菌群的影响 |
| 前言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验材料 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.1.4 实验试剂 |
| 4.1.5 实验试剂盒 |
| 4.1.6 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 肠道通透性 |
| 4.2.2 内毒素 |
| 4.2.3 24 h粪便量 |
| 4.2.4 结肠长度 |
| 4.2.5 LMWF对 DN大鼠肠道菌群的影响 |
| 4.2.6 肾脏功能相关指标与肠道菌群关联性分析 |
| 4.2.7 LMWF对粪乳杆菌生长的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 LMWF改善DN大鼠肠道病变 |
| 4.3.2 LMWF调节DN大鼠肠道菌群 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 发表的学术论文与研究成果 |
（4）人C1酯酶抑制剂制备工艺及检测方法的优化（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 第一章 试验材料 |
| 1.原料 |
| 2.主要仪器设备 |
| 3.主要试剂 |
| 4.溶液配制 |
| 第二章 实验方法 |
| 1.PEG4000沉淀法条件摸索试验 |
| 2.CM离子交换层析优化试验 |
| 3.主要检测方法 |
| 第三章 实验结果 |
| 1.PEG4000 对原料中IgM的去除 |
| 2.CM离子交换层析 |
| 3.改良的BCA总蛋白含量检测法 |
| 讨论 |
| 论文小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间文章及专利发表情况 |
| 致谢 |
（5）两种糖基化酪蛋白消化物的免疫活性与肠屏障功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 食品蛋白质的概述 |
| 1.2.1 蛋白质分类 |
| 1.2.2 蛋白质的生物活性 |
| 1.3 酪蛋白性质及其应用 |
| 1.3.1 组成 |
| 1.3.2 分子结构 |
| 1.3.3 胶束结构 |
| 1.3.4 重要功能性质及其应用 |
| 1.4 蛋白质的改性技术 |
| 1.4.1 物理改性 |
| 1.4.2 化学改性 |
| 1.4.3 酶法改性 |
| 1.5 美拉德反应途径蛋白质改性及其研究进展 |
| 1.5.1 美拉德反应机制 |
| 1.5.2 对蛋白质结构与功能性质的影响 |
| 1.5.3 对蛋白质生物活性的有益影响 |
| 1.5.4 对蛋白质生物活性的不良作用 |
| 1.6 转谷氨酰胺酶途径蛋白质改性及研究进展 |
| 1.6.1 转谷氨酰胺酶的性质 |
| 1.6.2 转谷氨酰胺酶的安全性及交联产物的生物可利用性 |
| 1.6.3 在食品加工中的应用 |
| 1.6.4 转谷氨酰胺酶途径糖基化修饰 |
| 1.7 免疫 |
| 1.7.1 免疫系统的组成 |
| 1.7.2 免疫系统的作用 |
| 1.7.3 免疫器官和免疫细胞的功能 |
| 1.7.4 免疫分子 |
| 1.7.5 食品成分对免疫系统的作用 |
| 1.8 肠道屏障功能 |
| 1.8.1 物理屏障 |
| 1.8.2 化学屏障 |
| 1.8.3 微生物屏障 |
| 1.8.4 免疫屏障 |
| 1.8.5 食品成分对肠道的健康作用 |
| 1.9 选题意义及研究内容 |
| 1.9.1 研究目的和意义 |
| 1.9.2 主要研究内容 |
| 1.9.3 研究创新点 |
| 第二章 试验材料与方法 |
| 2.1 研究的技术路线 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 原料与试剂 |
| 2.2.2 主要仪器与设备 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 两种糖基化酪蛋白消化物的制备 |
| 2.3.2 消化物的化学分析 |
| 2.3.3 消化物对小鼠免疫细胞的作用 |
| 2.3.4 消化物对小鼠体内免疫的作用 |
| 2.3.5 消化物对小肠上皮细胞屏障功能的影响 |
| 2.3.6 消化物对受损的小肠上皮细胞屏障功能的保护作用 |
| 2.3.7 数据处理与统计 |
| 第三章 两种糖基化酪蛋白消化物的化学分析 |
| 3.1 乳糖糖基化酪蛋白消化物化学特征 |
| 3.1.1 基本化学特征 |
| 3.1.2 消化物氨基酸的组成 |
| 3.1.3 消化物的糖基化位点 |
| 3.2 壳寡糖糖基化酪蛋白消化物化学特征 |
| 3.2.1 基本化学特征 |
| 3.2.2 消化物氨基酸的组成 |
| 3.2.3 消化物的糖基化位点 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 美拉德反应糖基化修饰 |
| 3.3.2 酶法糖基化修饰 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 糖基化酪蛋白消化物对小鼠免疫状态的影响 |
| 4.1 乳糖糖基化对酪蛋白消化物调节小鼠免疫细胞功能的影响 |
| 4.1.1 消化物对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用 |
| 4.1.2 消化物对小鼠巨噬细胞的吞噬作用 |
| 4.1.3 消化物对NK细胞活性的影响 |
| 4.1.4 消化物对免疫细胞因子分泌的影响 |
| 4.2 乳糖糖基化对酪蛋白消化物调节正常小鼠免疫状态的影响 |
| 4.2.1 消化物对正常小鼠生化指标的影响 |
| 4.2.2 消化物对正常小鼠血清免疫球蛋白分泌的影响 |
| 4.2.3 消化物对正常小鼠免疫器官指数的影响 |
| 4.2.4 消化物对正常小鼠免疫细胞活性的影响 |
| 4.3 乳糖糖基化对酪蛋白消化物调节免疫低下小鼠免疫状态影响 |
| 4.3.1 消化物对免疫低下小鼠生化指标的影响 |
| 4.3.2 消化物对免疫低下小鼠血清免疫球蛋白分泌的影响 |
| 4.3.3 消化物对免疫低下小鼠免疫器官指数的影响 |
| 4.3.4 消化物对免疫低下小鼠免疫细胞活性的影响 |
| 4.4 精准糖基化对酪蛋白消化物调节小鼠免疫细胞功能的影响 |
| 4.4.1 消化物对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用 |
| 4.4.2 消化物对小鼠巨噬细胞的吞噬作用 |
| 4.4.3 消化物对NK细胞活性的影响 |
| 4.4.4 消化物对免疫细胞因子分泌的影响 |
| 4.5 精准糖基化对酪蛋白消化物调节正常小鼠免疫状态的影响 |
| 4.5.1 消化物对正常小鼠生化指标的影响 |
| 4.5.2 消化物对正常小鼠血清免疫球蛋白分泌的影响 |
| 4.5.3 消化物对正常小鼠免疫器官指数的影响 |
| 4.5.4 消化物对正常小鼠免疫细胞活性的影响 |
| 4.6 精准糖基化对酪蛋白消化物调节免疫低下小鼠免疫状态影响 |
| 4.6.1 消化物对免疫低下小鼠生化指标的影响 |
| 4.6.2 消化物对免疫低下小鼠血清免疫球蛋白分泌的影响 |
| 4.6.3 消化物对免疫低下小鼠免疫器官指数的影响 |
| 4.6.4 消化物对免疫低下小鼠免疫细胞活性的影响 |
| 4.7 讨论 |
| 4.7.1 蛋白质糖基化修饰对体外免疫活性的影响 |
| 4.7.2 蛋白质糖基化修饰对体内免疫活性的影响 |
| 4.8 本章小结 |
| 第五章 糖基化酪蛋白消化物对小肠上皮细胞屏障功能的影响 |
| 5.1 乳糖糖基化对消化物提高小肠上皮细胞屏障功能的影响 |
| 5.1.1 消化物对小肠上皮细胞的增殖作用 |
| 5.1.2 消化物对小肠上皮细胞跨膜电阻的影响 |
| 5.1.3 消化物对小肠上皮细胞的细胞膜通透性的影响 |
| 5.1.4 消化物对小肠上皮细胞抗菌活性和细菌移位的影响 |
| 5.1.5 消化物对小肠上皮细胞蛋白质表达的影响 |
| 5.2 乳糖糖基化对消化物改善受损小肠上皮细胞屏障功能的影响 |
| 5.2.1 丙烯酰胺对小肠上皮细胞的毒性作用 |
| 5.2.2 消化物对受损小肠上皮细胞活性的影响 |
| 5.2.3 消化物对受损小肠上皮细胞跨膜电阻的影响 |
| 5.2.4 消化物对受损小肠上皮细胞的细胞膜通透性的影响 |
| 5.2.5 消化物对受损小肠上皮细胞蛋白质表达的影响 |
| 5.3 精准糖基化对消化物改善小肠上皮细胞屏障功能的影响 |
| 5.3.1 消化物对小肠上皮细胞的增殖作用 |
| 5.3.2 消化物对小肠上皮细胞跨膜电阻的影响 |
| 5.3.3 消化物对小肠上皮细胞的细胞膜通透性的影响 |
| 5.3.4 消化物对小肠上皮细胞抗菌活性和细菌移位影响 |
| 5.3.5 消化物对小肠上皮细胞蛋白质表达的影响 |
| 5.4 精准糖基化对消化物改善受损小肠上皮细胞屏障功能的影响 |
| 5.4.1 消化物对受损小肠上皮细胞活性的影响 |
| 5.4.2 消化物对受损小肠上皮细胞跨膜电阻的影响 |
| 5.4.3 消化物对受损小肠上皮细胞的细胞膜通透性的影响 |
| 5.4.4 消化物对受损小肠上皮细胞蛋白质表达的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.5.1 蛋白质糖基化与其对小肠上皮细胞屏障功能的改善作用 |
| 5.5.2 蛋白质糖基化与其对受损小肠上皮细胞屏障功能的改善作用 |
| 5.6 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（6）MDCK细胞基质与鸡胚基质培养对流感病毒及其疫苗影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 流感病毒简介 |
| 1.2 流感的历史、流行病学及疾病负担 |
| 1.3 流感病毒疫苗 |
| 1.3.1 早期的流感疫苗 |
| 1.3.2 鸡胚基质流感疫苗 |
| 1.3.3 细胞基质流感疫苗 |
| 1.3.4 其他在研流感疫苗 |
| 1.3.5 鸡胚基质与细胞基质流感疫苗的比较 |
| 1.3.6 不同基质对病毒糖基化的影响 |
| 1.4 本文的研究目的、内容和意义 |
| 第二章 MDCK细胞基质流感疫苗的制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 病毒 |
| 2.1.3 其它材料 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 MDCK-G1株贴壁细胞的复苏 |
| 2.2.2 MDCK-G1-XF株细胞的复苏 |
| 2.2.3 贴壁细胞传代 |
| 2.2.4 悬浮细胞传代 |
| 2.2.5 细胞计数 |
| 2.2.6 悬浮细胞的冻存 |
| 2.2.7 生物反应器的准备 |
| 2.2.8 细胞接种 |
| 2.2.9 病毒建库及检测 |
| 2.2.10 病毒接种 |
| 2.2.11 病毒纯化 |
| 2.2.12 检测方法 |
| 2.2.13 广谱核酸酶处理 |
| 2.2.14 电镜检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 CaptoTM Core700 纯化结果 |
| 2.3.2 CaptoTM Q纯化结果 |
| 2.3.3 广谱核酸酶处理结果 |
| 2.3.4 电镜检测结果 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 MDCK细胞基质与鸡胚基质培养的H1N1 病毒中糖蛋白HA生物学特性比较研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 MDCK培养的H1N1 病毒 |
| 3.1.2 鸡胚培养的H1N1病毒 |
| 3.1.3 其它材料 |
| 3.1.4 主要仪器及耗材 |
| 3.1.5 主要试剂 |
| 3.1.6 主要试剂的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 H1N1病毒RNA提取 |
| 3.2.2 H1N1病毒RNA反转录 |
| 3.2.3 SDS-PAGE分离HA蛋白 |
| 3.2.4 Westrn Blotting检测 |
| 3.2.5 HA蛋白蛋白序列检测 |
| 3.2.6 HA蛋白理论序列的分析 |
| 3.2.7 HA蛋白糖基化位点鉴定 |
| 3.2.8 HA蛋白糖谱检定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 HA核酸测序结果 |
| 3.3.2 HA纯化结果 |
| 3.3.3 HA蛋白序列检测结果 |
| 3.3.4 HA蛋白三维结构图 |
| 3.3.5 糖基化位点预测 |
| 3.3.6 糖基化位点及糖肽检测结果 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 MDCK细胞基质疫苗与鸡胚基质疫苗的免疫原性及保护性比较研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验用细胞 |
| 4.1.2 实验用疫苗 |
| 4.1.3 其它材料 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 主要试剂 |
| 4.1.6 主要试剂的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 H1N1病毒的效价测定 |
| 4.2.2 H1N1病毒的N-糖苷酶酶切 |
| 4.2.3 SDS-PAGE 电泳检测 |
| 4.2.4 Western Blotting 检测 |
| 4.2.5 动物实验 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 N-糖苷酶酶切结果 |
| 4.3.2 多因子组I检测结果 |
| 4.3.3 多因子组II检测结果 |
| 4.3.4 胞内因子染色组检测结果 |
| 4.3.5 体外细胞中和组检测结果 |
| 4.3.6 血凝抑制实验结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 讨论 |
| 5.1 流感病毒的纯化 |
| 5.2 培养基质对病毒的影响 |
| 5.2.1 培养基质对于病毒核酸的影响 |
| 5.2.2 培养基质对于病毒氨基酸的影响 |
| 5.2.3 培养基质对于病毒糖基化修饰的影响 |
| 5.3 流感病毒蛋白糖基化修饰对疫苗免疫原性、有效性及检定的影响 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 6.3 创新点 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ |
| 附录Ⅱ |
| 附录Ⅲ |
| 附录Ⅳ |
| 附录Ⅴ |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
（7）烘烤对花生致敏性的影响及其机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 花生过敏概述 |
| 1.1 花生过敏的危害及评价研究的方法 |
| 1.2 花生过敏原与过敏机理 |
| 2 花生烘烤处理对过敏原致敏性的影响 |
| 2.1 烘烤对过敏原结构和生物利用度的影响 |
| 2.2 烘烤对过敏原糖基化反应的影响 |
| 2.3 烘烤对抗原呈递细胞呈递过敏原蛋白的影响 |
| 2.4 烘烤对过敏原调控Th1/Th2型反应平衡的影响 |
| 3 本课题的研究目的及意义 |
| 第二章 烘烤对花生蛋白糖基化和致敏性的影响 |
| 1 实验材料、试剂及仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 烘烤对花生蛋白含量及糖基化的影响 |
| 3.1.1 研磨方式及搅拌时间对花生蛋白提取效果的影响 |
| 3.1.2 烘烤条件对花生蛋白含量的影响 |
| 3.1.3 烘烤条件对花生蛋白糖基化程度的影响 |
| 3.2 BALB/c小鼠模型在烘烤花生致敏性评价上的应用 |
| 3.2.1 病理指标的观察 |
| 3.2.2 小肠和肺组织中TSLP基因相对表达量的检测 |
| 3.2.3 花生对小鼠血清中细胞因子含量的影响 |
| 3.2.4 花生对小鼠血清中特异性抗体含量的影响 |
| 3.2.5 花生对小鼠血清中组胺含量的影响 |
| 3.2.6 烘烤对花生蛋白与小鼠血清IgE结合能力的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第三章 烘烤花生Arah3的纯化及致敏的机理研究 |
| 1 实验材料、试剂及仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 烘烤对花生Arah3结构、糖基化和致敏性的影响 |
| 3.1.1 花生Arah3纯化条件的筛选 |
| 3.1.2 花生Arah3微观结构的检测 |
| 3.1.3 花生Arah3糖基化的检测 |
| 3.1.4 花生Ara h3与IgE、IgG结合能力的竞争抑制ELISA检测 |
| 3.2 烘烤花生Arah3致敏性增强的机理研究 |
| 3.2.1 Caco-2 细胞在评价烘烤花生Ara h3 致敏性增强机理的应用 |
| 3.2.2 树突状细胞在评价烘烤花生Arah3致敏性增强机理的应用 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第四章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 作者在攻读硕士学位期间公开发表的论文 |
| 作者在攻读硕士学位期间参与的项目 |
| 致谢 |
（8）马里苷单克隆抗体的制备以及抗糖尿病肾病机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 马里苷单克隆抗体的制备以及酶联免疫分析方法的建立 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 溶液配制 |
| 1.3 马里苷人工抗原制备 |
| 1.4 马里苷人工抗原的鉴定 |
| 1.5 动物免疫 |
| 1.6 细胞融合 |
| 1.7 杂交瘤细胞的克隆化 |
| 1.8 单克隆抗体的大量制备及抗体纯化 |
| 1.9 获得马里苷单克隆抗体的性质鉴定以及ic-ELISA建立 |
| 1.10 基于马里苷单克隆抗体ic-ELISA方法应用 |
| 1.11 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 马里苷人工抗原鉴定 |
| 2.2 动物免疫 |
| 2.3 细胞融合、筛选以及抗体制备及纯化 |
| 2.4 马里苷单克隆抗体性质考察以及间接竞争ELISA方法建立 |
| 2.5 基于马里苷单克隆抗体ic-ELISA方法应用 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 马里苷在MDCK单层细胞模型转运特性研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 溶液配制 |
| 1.3 马里苷UPLC-MS/MS含量测定方法的建立 |
| 1.4 MDCK细胞培养操作 |
| 1.5 MTT实验操作 |
| 1.6 MDCK单层细胞模型的建立 |
| 1.7 不同条件下马里苷在MDCK单层细胞模型的跨膜转运 |
| 1.8 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 马里苷MTT实验结果 |
| 2.2 MDCK单层细胞完整性考察 |
| 2.3 影响马里苷在MDCK单层细胞模型上的跨膜转运因素考察 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 马里苷对高糖干预HK-2细胞SGLT2表达影响 |
| 1 研究内容和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 溶液配制 |
| 1.3 细胞培养操作 |
| 1.4 MTT实验操作 |
| 1.5 HK-2细胞高糖模型的建立 |
| 1.6 细胞转染操作 |
| 1.7 Western-blot检测细胞相关蛋白的表达 |
| 1.8 免疫荧光操作 |
| 1.9 2-NBDG荧光葡萄糖摄取操作 |
| 1.10 RT-qPCR检测总mRNA表达水平 |
| 1.11 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 马里苷对正常HK-2细胞SGLT2,AMPK,ACC蛋白表达以及对2-NBDG荧光葡萄糖摄取的影响 |
| 2.2 马里苷抑制高糖诱导HK-2细胞SGLT2表达增高以及保护高糖损伤机制探讨 |
| 2.3 马里苷对SGLT2过表达HK-2细胞的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四部分 马里苷抗糖尿病肾病机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 溶液配制 |
| 1.3 动物分组及处理 |
| 1.4 血清生化指标测定 |
| 1.5 石蜡切片 |
| 1.6 苏木素·伊红(H&E)染色 |
| 1.7 PAS染色 |
| 1.8 Masson染色 |
| 1.9 肾组织的透射电镜 |
| 1.10 免疫组化(IHC)操作 |
| 1.11 组织免疫荧光-石蜡切片(IF) |
| 1.12 油红O染色 |
| 1.13 Westem-Blot检测肾组织相关蛋白表达 |
| 1.14 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠一般情况观察 |
| 2.2 马里苷对小鼠体重和肾重的影响 |
| 2.3 血清生化指标检测 |
| 2.4 马里苷对db/db糖尿病小鼠肾脏病理学的影响 |
| 2.5 马里苷对肾脏组织SGLT2蛋白表达的影响 |
| 2.6 马里苷通过改善肾脏脂毒性而缓解糖尿病肾病 |
| 2.7 马里苷对db/db小鼠糖尿病肾脏炎症和纤维化的影响 |
| 2.8 马里苷对胰岛组织形态结构和胰岛素分泌的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 糖脂代谢紊乱对糖尿病肾病的影响 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文 导师评阅表 |
（9）基于乳清分离蛋白的载体材料构建及对功能因子的稳态作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 乳清蛋白及乳清蛋白基食品传递体系 |
| 1.1.1 微乳液或纳米乳液 |
| 1.1.2 纳米复合物或纳米粒子 |
| 1.1.3 水凝胶或乳液凝集 |
| 1.2 蛋白质-多糖共价复合物的研究进展 |
| 1.2.1 蛋白质-多糖共价反应机理 |
| 1.2.2 蛋白质-多糖共价复合物的制备方法 |
| 1.2.2.1 传统方法 |
| 1.2.2.2 其他方法 |
| 1.2.3 蛋白质-多糖共价复合物的功能性质 |
| 1.2.3.1 溶解度 |
| 1.2.3.2 热稳定性 |
| 1.2.3.3 乳化性 |
| 1.2.3.4 凝胶性 |
| 1.2.3.5 起泡性 |
| 1.2.4 蛋白质-多糖共价复合物在传递体系中的应用 |
| 1.3 蛋白质-多酚共价复合物的研究进展 |
| 1.3.1 蛋白质-多酚共价复合物的制备方法及机理 |
| 1.3.2 蛋白质-多酚共价复合物的功能性质 |
| 1.3.2.1 抗氧化性 |
| 1.3.2.2 溶解度 |
| 1.3.2.3 热稳定性 |
| 1.3.2.4 乳化性 |
| 1.3.2.5 凝胶性 |
| 1.3.2.6 起泡性 |
| 1.3.3 蛋白质-多酚共价复合物在传递体系中的应用 |
| 1.4 本论文背景、研究意义、研究内容和技术路线图 |
| 1.4.1 研究背景和研究意义 |
| 1.4.2 研究内容和技术路线 |
| 第二章 干法糖基化对乳清分离蛋白结构和功能性质的影响 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 材料与试剂 |
| 2.1.2 仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 WPI-GA共价复合物的制备 |
| 2.2.2 接枝度的测定 |
| 2.2.3 褐变强度的测定 |
| 2.2.4 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 |
| 2.2.5 高效排阻色谱分析 |
| 2.2.6 圆二色谱分析 |
| 2.2.7 内源荧光光谱分析 |
| 2.2.8 表面疏水性分析 |
| 2.2.9 溶解度分析 |
| 2.2.10 差式扫描量热分析 |
| 2.2.11 热稳定性分析 |
| 2.2.12 乳化性质分析 |
| 2.2.13 数据处理与分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 反应时间对接枝度和褐变强度的影响 |
| 2.3.2 共价复合物结构表征 |
| 2.3.2.1 SDS-PAGE分析 |
| 2.3.2.2 HPSEC分析 |
| 2.3.2.3 圆二色谱分析 |
| 2.3.2.4 内源荧光分析 |
| 2.3.2.5 表面疏水性分析 |
| 2.3.3 共价复合物功能性质分析 |
| 2.3.3.1 溶解性 |
| 2.3.3.2 热稳定性 |
| 2.3.3.3 乳化性 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 超声辅助糖基化对乳清分离蛋白结构和功能性质的影响 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 材料与试剂 |
| 3.1.2 仪器与设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 超声辅助制备WPI-GA共价复合物 |
| 3.2.2 接枝度的测定 |
| 3.2.3 褐变强度的测定 |
| 3.2.4 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 |
| 3.2.5 高效排阻色谱分析 |
| 3.2.6 圆二色谱分析 |
| 3.2.7 内源荧光光谱分析 |
| 3.2.8 表面疏水性分析 |
| 3.2.9 溶解度分析 |
| 3.2.10 差示扫描量热分析 |
| 3.2.11 热稳定性分析 |
| 3.2.12 乳化性质分析 |
| 3.2.13 数据处理与分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 制备条件对接枝度的影响 |
| 3.3.1.1 超声温度对接枝反应的影响 |
| 3.3.1.2 超声功率对接枝反应的影响 |
| 3.3.1.3 初始pH值对接枝反应的影响 |
| 3.3.1.4 WPI浓度对接枝反应的影响 |
| 3.3.1.5 蛋白质-多糖质量比对接枝反应的影响 |
| 3.3.2 超声辅助糖基化条件的确定 |
| 3.3.3 褐变强度分析 |
| 3.3.4 共价复合物结构表征 |
| 3.3.4.1 SDS-PAGE分析 |
| 3.3.4.2 HPSEC分析 |
| 3.3.4.3 圆二色谱分析 |
| 3.3.4.4 内源荧光分析 |
| 3.3.4.5 表面疏水性分析 |
| 3.3.5 超声强化WPI-GA接枝反应机理分析 |
| 3.3.6 共价复合物功能性质分析 |
| 3.3.6.1 溶解性 |
| 3.3.6.2 热稳定性 |
| 3.3.6.3 乳化性 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 WPI-GA共价复合物对EGCG的稳态作用研究 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 材料与试剂 |
| 4.1.2 仪器与设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 干热法制备WPI-GA共价复合物 |
| 4.2.2 超声辅助制备WPI-GA共价复合物 |
| 4.2.3 荧光光谱分析 |
| 4.2.4 蛋白质-EGCG纳米复合物的制备 |
| 4.2.5 粒径测定 |
| 4.2.6 负载率测定 |
| 4.2.7 EGCG稳定性分析 |
| 4.2.8 抗氧化活性分析 |
| 4.2.9 模拟胃肠道条件 |
| 4.2.10 EGCG生物有效应分析 |
| 4.2.11 数据处理与分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 糖基化对WPI同 EGCG相互作用的影响 |
| 4.3.2 糖基化对WPI负载EGCG能力的影响 |
| 4.3.3 糖基化对EGCG诱导的WPI聚集的影响 |
| 4.3.4 纳米复合物中EGCG稳定性分析 |
| 4.3.5 纳米复合物抗氧化活性分析 |
| 4.3.6 EGCG生物有效性 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 WPI-GA共价复合物稳定β-胡萝卜素纳米乳液的研究 |
| 5.1 材料与仪器 |
| 5.1.1 材料与试剂 |
| 5.1.2 仪器与设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 干热法制备WPI-GA共价复合物 |
| 5.2.2 超声辅助制备WPI-GA共价复合物 |
| 5.2.3 β-胡萝卜素纳米乳液的制备 |
| 5.2.4 显微镜观察 |
| 5.2.5 粒径和电位测定 |
| 5.2.6 β-胡萝卜素含量的测定 |
| 5.2.7 纳米乳液的物理稳定性 |
| 5.2.7.1 冻融对纳米乳液稳定性的影响 |
| 5.2.7.2 离子强度对纳米乳液稳定性的影响 |
| 5.2.7.3 热处理对纳米乳液稳定性的影响 |
| 5.2.7.4 pH对纳米乳液稳定性的影响 |
| 5.2.8 纳米乳液中β-胡萝卜素的化学稳定性 |
| 5.2.8.1 β-胡萝卜素的紫外光照稳定性 |
| 5.2.8.2 β-胡萝卜素的储藏稳定性 |
| 5.2.9 模拟胃肠道条件 |
| 5.2.10 β-胡萝卜素生物有效性 |
| 5.2.11 数据处理与分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 β-胡萝卜素纳米乳液的微观形态和粒径分布 |
| 5.3.2 β-胡萝卜素纳米乳液的物理稳定性 |
| 5.3.2.1 冻融稳定性 |
| 5.3.2.2 盐离子稳定性 |
| 5.3.2.3 热稳定性 |
| 5.3.2.4 酸碱稳定性 |
| 5.3.3 纳米乳液中β-胡萝卜素的化学稳定性 |
| 5.3.3.1 紫外光照稳定性 |
| 5.3.3.2 储藏稳定性 |
| 5.3.4 消化过程中β-胡萝卜素纳米乳液的稳定性 |
| 5.3.5 β-胡萝卜素生物有效性 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 WPI-EGCG共价复合物的制备及在β-胡萝卜素纳米乳液中的应用 |
| 6.1 材料与仪器 |
| 6.1.1 材料与试剂 |
| 6.1.2 仪器与设备 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 WPI-EGCG共价复合物的制备 |
| 6.2.2 自由氨基含量的测定 |
| 6.2.3 巯基含量的测定 |
| 6.2.4 游离色氨酸的测定 |
| 6.2.5 EGCG接枝量测定 |
| 6.2.6 傅里叶变换红外光谱分析 |
| 6.2.7 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 |
| 6.2.8 圆二色谱分析 |
| 6.2.9 内源荧光光谱分析 |
| 6.2.10 表面疏水性分析 |
| 6.2.11 差式扫描量热分析 |
| 6.2.12 抗氧化活性分析 |
| 6.2.13 β-胡萝卜素纳米乳液的制备 |
| 6.2.14 显微镜观察 |
| 6.2.15 粒径和电位测定 |
| 6.2.16 β-胡萝卜素含量的测定 |
| 6.2.17 纳米乳液中β-胡萝卜素的化学稳定性 |
| 6.2.18 数据处理与分析 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 反应基团和接枝率分析 |
| 6.3.2 WPI-EGCG共价复合物结构表征 |
| 6.3.2.1 傅里叶变换红外光谱分析 |
| 6.3.2.2 SDS-PAGE分析 |
| 6.3.2.3 圆二色谱分析 |
| 6.3.2.4 内源荧光和表面疏水性分析 |
| 6.3.3 WPI-EGCG共价复合物热稳定性和抗氧化活性分析 |
| 6.3.4 WPI-EGCG共价复合物在β-胡萝卜素纳米乳液中的应用 |
| 6.3.4.1 纳米乳液的微观形态和粒径分布 |
| 6.3.4.2 β-胡萝卜素的化学稳定性 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 WPI-EGCG-GA共价复合物的制备及在β-胡萝卜素纳米乳液中的应用 |
| 7.1 材料与仪器 |
| 7.1.1 材料与试剂 |
| 7.1.2 仪器与设备 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 三元共价复合物的制备 |
| 7.2.2 EGCG接枝量的测定 |
| 7.2.3 GA接枝度的测定 |
| 7.2.4 傅里叶变换红外光谱分析 |
| 7.2.5 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 |
| 7.2.6 高效排阻色谱分析 |
| 7.2.7 圆二色谱分析 |
| 7.2.8 内源荧光光谱分析 |
| 7.2.9 表面疏水性分析 |
| 7.2.10 差示扫描量热分析 |
| 7.2.11 抗氧化活性分析 |
| 7.2.12 β-胡萝卜素纳米乳液的制备 |
| 7.2.13 显微镜观察 |
| 7.2.14 粒径和电位测定 |
| 7.2.15 β-胡萝卜素含量的测定 |
| 7.2.16 纳米乳液的物理稳定性 |
| 7.2.16.1 冻融对纳米乳液稳定性的影响 |
| 7.2.16.2 离子强度对纳米乳液稳定性的影响 |
| 7.2.16.3 热处理对纳米乳液稳定性的影响 |
| 7.2.16.4 pH对纳米乳液稳定性的影响 |
| 7.2.17 纳米乳液中β-胡萝卜素的化学稳定性 |
| 7.2.17.1 β-胡萝卜素的紫外光照稳定性 |
| 7.2.17.2 β-胡萝卜素的热稳定性 |
| 7.2.18 模拟胃肠道条件 |
| 7.2.19 β-胡萝卜素生物有效性 |
| 7.2.20 数据处理与分析 |
| 7.3 结果与讨论 |
| 7.3.1 接枝顺序对三元共价复合物接枝率的影响 |
| 7.3.2 三元共价复合物结构表征 |
| 7.3.2.1 傅里叶变换红外光谱分析 |
| 7.3.2.2 分子量分析 |
| 7.3.2.3 二级结构分析 |
| 7.3.2.4 内源荧光和表面疏水性分析 |
| 7.3.3 三元共价复合物的热稳定性和抗氧化活性分析 |
| 7.3.4 三元共价复合物稳定的β-胡萝卜素纳米乳液的理化稳定性 |
| 7.3.4.1 纳米乳液的微观形态和粒径分布 |
| 7.3.4.2 纳米乳液的物理稳定性 |
| 7.3.4.3 β-胡萝卜素的化学稳定性 |
| 7.3.5 β-胡萝卜素纳米乳液的消化稳定性和生物有效性 |
| 7.3.5.1 纳米乳液消化稳定性 |
| 7.3.5.2 β-胡萝卜素生物有效性 |
| 7.4 本章小结 |
| 第八章 结论与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 创新点 |
| 8.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（10）藏鸡种蛋氧化应激响应蛋白质的筛选及其PIT54对血管生成机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 鸡蛋蛋白质的主要功能 |
| 1.1 抗氧化活性(氧化应激响应活性) |
| 1.2 抗菌活性 |
| 1.3 血管紧张素转移酶抑制活性 |
| 1.4 抗病毒活性 |
| 1.5 其他生物活性 |
| 2 蛋白质组学研究 |
| 2.1 蛋白质组学的常用技术 |
| 2.2 蛋白质组学技术的应用 |
| 2.3 鸡蛋蛋白质翻译后的研究 |
| 3 藏鸡蛋的研究进展 |
| 3.1 藏鸡蛋蛋壳的研究进展 |
| 3.2 低氧孵化对鸡胚组织器官的影响 |
| 3.3 低氧适应性相关蛋白质的研究 |
| 4 PIT54及血管生成的研究进展 |
| 4.1 PIT54的相关研究 |
| 4.2 血管生成及常用的模型 |
| 4.3 促血管生成因子对于血管生成的影响 |
| 5 本课题选题的学术思想 |
| 5.1 研究目的与意义 |
| 5.2 学术思想 |
| 5.3 主要研究内容 |
| 第二章 两种海拔高度鸡种蛋蛋清蛋白质组的比较研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 EW基本营养成分分析 |
| 2.2 蛋清蛋白质的GO分类分析 |
| 2.3 差异蛋白质的生物信息学分析 |
| 2.4 生物信息学分析两组的抗氧化活性差异 |
| 2.5 CEW和 TEW的抗氧化活性测定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 差异蛋白质的功能分析 |
| 3.2 抗氧化相关蛋白质的筛选 |
| 4 小结 |
| 第三章 两种海拔高度鸡种蛋蛋黄蛋白质组的比较研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果和讨论 |
| 2.1 TEY和 CEY的基本营养成分分析及其蛋白质的鉴定 |
| 2.2 TEY和 CEY中差异表达的蛋白质 |
| 2.3 差异蛋白质的生物信息学分析 |
| 2.4 生物信息学分析差异蛋白质与抗氧化活性相关 |
| 2.5 藏鸡和白来航鸡抗氧化活性相关的蛋白和基因 |
| 2.6 体外抗氧化测定 |
| 2.7 细胞毒性/细胞保护作用 |
| 3 讨论 |
| 3.1 差异蛋白质的功能分析 |
| 3.2 CEYH和 TEYH对于Caco-2 细胞的保护作用 |
| 3.3 鉴定与抗氧化活性有关的蛋黄蛋白质 |
| 4 小结 |
| 第四章 两种海拔高度鸡种蛋抗氧化蛋白质筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 蛋白质注释 |
| 1.3 鸡蛋抗氧化活性蛋白质的筛选 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 比较本研究中鉴定的蛋白质与已报道蛋白质 |
| 2.2 构建蛋清和蛋黄中蛋白质数据集 |
| 2.3 确定抗氧化活性候选蛋白质 |
| 2.4 PIT54的功能分析与同源比对 |
| 3 讨论 |
| 3.1 鸡蛋中抗氧化活性蛋白质的筛选 |
| 3.2 PIT54的生物活性预测分析 |
| 3.3 PIT54的保守性分析 |
| 4 小结 |
| 第五章 两种海拔高度鸡种蛋蛋黄PIT-54的纯化与质谱分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 血红蛋白的提取及亲和层析柱的制备 |
| 2.2 PIT54蛋白质纯化 |
| 2.3 质谱鉴定 |
| 2.4 PIT54与血红蛋白的结合能力 |
| 2.5 PIT54抗氧化能力的测定 |
| 2.6 两种来源的PIT54糖基化位点鉴定 |
| 2.7 两种蛋白质的磷酸化位点差异鉴定 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 两种海拔高度PIT54对CAM血管生成的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 低氧孵化过程的模拟与控制 |
| 2.2 调试与孵化测试 |
| 2.3 鸡胚尿囊绒毛膜的给药时间点筛选 |
| 2.4 两种PIT54 对于鸡胚CAM的血管发育的影响 |
| 3.讨论 |
| 3.1 高原低氧孵化箱的模拟与控制 |
| 3.2 不同孵化时间对于CAM血管生成的影响 |
| 3.3 不同药物对于鸡胚CAM血管发育的影响 |
| 4 小结 |
| 第七章 两种海拔PIT54对CAM血管生成机制的探究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PIT54抗体的制备与效果评价 |
| 2.2 PIT54的表达部分探测 |
| 2.3 C-PIT54和T-PIT54对HIF-1α表达量的影响 |
| 2.4 不同药物处理对VEGFR2/Src信号分子机制的影响 |
| 2.5 C-PIT54和T-PIT54对PI3K/Akt信号分子机制的影响 |
| 2.6 C-PIT54和T-PIT54对ERK和p38 及各自磷酸化水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 PIT54表达部位分析 |
| 3.2 C-PIT54和T-PIT54 对血管生成相关蛋白的影响 |
| 3.3 PIT54 影响鸡胚CAM血管生成的机制 |
| 4 小结 |
| 第八章 两种海拔高度鸡PIT54基因测序比较 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 载体的构建与酶切鉴定 |
| 2.2 PIT54 protein基因DNA结构分析 |
| 2.3 不同来源的PIT54 protein基因DNA序列比较分析 |
| 2.4 预测的T-PIT54与C-PIT54 氨基酸序列的比较分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第九章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 创新性 |
| 3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
四、糖基化白蛋白液中糖含量的不同定量方法比较（论文参考文献）
- [1]长效化胰高血糖素样肽-1类似物设计、合成及降糖活性研究[D]. 戴士杰. 江南大学, 2021(01)
- [2]质谱鉴定中药阿胶的胶原蛋白和糖胺聚糖及研究糖胺聚糖与趋化因子的相互作用[D]. 李雪. 山东大学, 2020(11)
- [3]海带低分子量褐藻多糖硫酸酯对糖尿病肾病的作用机制研究[D]. 王菁. 中国科学院大学(中国科学院海洋研究所), 2020(01)
- [4]人C1酯酶抑制剂制备工艺及检测方法的优化[D]. 纪德铭. 武汉生物制品研究所, 2020(01)
- [5]两种糖基化酪蛋白消化物的免疫活性与肠屏障功能研究[D]. 时佳. 东北农业大学, 2020(04)
- [6]MDCK细胞基质与鸡胚基质培养对流感病毒及其疫苗影响的研究[D]. 张哲罡. 武汉生物制品研究所, 2020(01)
- [7]烘烤对花生致敏性的影响及其机理研究[D]. 王闽佳. 上海大学, 2020(02)
- [8]马里苷单克隆抗体的制备以及抗糖尿病肾病机制研究[D]. 郭艳丽. 新疆医科大学, 2020(08)
- [9]基于乳清分离蛋白的载体材料构建及对功能因子的稳态作用研究[D]. 陈卫军. 浙江大学, 2020
- [10]藏鸡种蛋氧化应激响应蛋白质的筛选及其PIT54对血管生成机制的研究[D]. 刘亚平. 华中农业大学, 2019(01)