一、免疫磁化分离法检测猪链球菌（论文文献综述）
龙梦瑶[1]（2018）在《肠出血性大肠杆菌O157:H7的IMS-RT-PCR和镧系荧光微球免疫层析检测方法的建立》文中提出肠出血性大肠杆菌O157:H7（EHEC O157）是近年来发现的重要食源性病原菌之一。它可以通过肉制品传染给人,能够引起人感染性腹泻。病情严重者会恶化为出血性结肠炎等病症。该细菌引起的疾病死亡率较高,感染剂量非常低。有报道称,人类摄入10～100个以上的活菌就可能致病,故建立一种快速、灵敏的检测方法已经变得迫在眉睫,也是预防肉制品引发疾病感染的关键。目前国内外报道关于EHEC O157:H7的检测方法主要分为选择性培养基分离鉴定、PCR检测、ELISA、血清分型检测、免疫磁珠分离法等,但随着食品加工和运输的迅速发展,沿用标准隔夜培养方法分离、富集微生物病原菌,存在一定的缺陷,如处理时间长、杂菌的干扰、假阳性的存在。因而,将样品前处理与检测方法的互相结合,已经成为防范肉制品感染疾病的重要手段。本研究将自主研制的抗EHEC O157:H7 O-SP单克隆抗体用以制备特异性免疫磁珠,从而建立快速检测EHEC O157:H7的IMS-RT-PCR技术以及制备镧系荧光微球标记的试纸条,最终建立多种快速的检测EHEC O157:H7的方法。试验I 抗EHEC O157:H7单克隆抗体的制备及鉴定利用热酚-水法提取EHEC O157:H7脂多糖（LPS）,将水相脂多糖和酚相脂多糖分离,应用酸解法制备O-特异性多糖（O-spectific polysaccharides,O-SP）,采用苯酚-浓硫酸法测定O-SP浓度为40 μg/mL。将浓度为2×109 CFU/mL的EHEC O157:H7甲醛灭活后制备全菌免疫原,免疫8周龄雌性Balb/c小鼠。以EHEC O157:H7灭活菌体与O-SP分别作为包被原,用间接ELISA方法依次筛选分泌EHEC O157:H7 O-SP抗体的阳性细胞克隆。然后用腹腔注射腹水法制备单抗,并采用间接ELISA方法测得腹水抗体效价>1:1×106,使用HiTrapTM Protein G纯化柱纯化单克隆抗体后,测得纯化抗体的浓度为1.79 mg/mL。本研究制备的EHEC O157 O-SP单克隆抗体仅与EHEC O157:H7细菌有结合反应,与其它细菌（大肠杆菌种属或者其它种属细菌）均无交叉反应,具备高特异性。可见,本研究制备的单克隆抗体具有良好的特性,为建立EHEC O157:H7快速检测技术奠定了良好的基础。试验Ⅱ 采用IMS-RT-PCR方法快速检测肉制品中EHEC O157:H7将免疫磁珠分离法（IMS）与实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术相结合,建立一种快速检测肉制品中EHEC O157:H7细菌的方法。将PM 3-50纳米磁珠经3-乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化后,与抗EHEC O157:H7 O-SP单克隆抗体结合,得到偶联量为150 μg/mg的免疫磁珠。免疫磁珠的最高捕获量为13748.33 CFU/0.2 mg,在肉制品中特异性捕获的最低检测限为2.2 CFU/mL。根据EHEC O157血清型的特异性基因rfbE（GenBank登录号:S83460）设计引物和荧光探针,将IMS与RT-PCR相结合进行检测EHEC 0157。当肉制品中EHEC 0157含量≥1 CFU/g（2.5 g样本）,免疫磁珠也能捕获,并通过EC肉汤培养基增殖3 h后,RT-PCR即可成功检测,全程只需6～7 h。IMS-RT-PCR相结合的检测方法,在进一步缩短了检测时间的基础上,再次降低了 EHEC O157:H7的检测限,在防范肉制品源性致病性EHEC O157:H7传染方面具有重要意义。试验Ⅲ 制备镧系荧光微球免疫层析试纸条快速检测EHEC O157:H7用镧系荧光微球标记单克隆抗体制备的免疫层析试纸条,可用于快速、便捷地检测肠出血性大肠杆菌O157:H7。镧系荧光微球经3-乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化后与抗EHEC O157:H7 O-SP单克隆抗体结合,形成镧系荧光微球标记单抗。镧系荧光微球标记单抗作为示踪抗体,试纸条NC膜（nitrocellulose membrane,NC membrane）的T线包被的抗EHEC O157:H7多抗为捕获抗体,形成双抗夹心法对EHEC O157:H7进行检测。在最优条件下,通过紫外激发出荧光时,本研究制备的试纸条肉眼可见的最低检测限为104 CFU/mL;结合荧光强度读取仪时,该试纸条最低检测限可提高为102 CFU/mL,该检测限相比于胶体金试纸条、ELISA检测方法降低了两个数量级。该试纸条与实验室保存的其它11株菌株均无交叉反应,与从猪肉或猪排泄物中分离的5株EHEC O157分离株均产生良好反应。镧系荧光微球作为标记物的免疫层析试纸条的检测过程简单、快速、敏感性强、特异性强。该试纸条可定量检测EHEC O157:H7的同时,还可以大大缩短检测时间,这将在防范致病性EHEC O157传染方面具有重要意义。
马超[2]（2018）在《基于纳米磁分离和化学发光的肝炎分子检测新技术研究》文中进行了进一步梳理随着纳米技术的迅速发展,纳米材料逐渐被应用到生命科学与医学领域中,从而为生命科学与医学的研究和发展提供了新的技术和手段。磁性纳米颗粒（magnetic nanoparticles,MNPs）作为纳米材料的一个重要组成部分,目前已被广泛应用于各种生物分子的检测等方面。化学发光具有安全、高灵敏度、线性范围宽等特点,为疾病的分子检测提供了一个良好的平台。本论文以肝炎为检测对象,结合化学发光和磁分离技术的优点,建立了几种快速、高通量、灵敏和实用的肝炎分子检测新技术。具体内容包括:1.功能化磁性纳米颗粒的制备及在核酸提取中应用为提高磁性纳米颗粒功能化结合分子检测探针量,本章在进行乙肝样本高灵敏检测研究前对传统功能化磁性纳米颗粒的制备方法进行了改进,首先采用软模板法制备Fe304磁性纳米颗粒,并进行包被SiO2实验。包被前平均直径为500 nm,且为圆颗粒,大小比较均一,具有超顺磁性,饱和磁化强度为1.7374emu/g,制备的包被SiO2复合Fe3O4颗粒大小,平均粒径为700nm,制备后的Fe3O4@SiO2具有明显的核壳结构,具有较好的分散性,颗粒为圆形,大小均一。将磁性纳米颗粒应用于细菌和全血样本核酸提取中均获得良好的提取效果,有望开发出磁珠分离法核酸提取试剂盒。2.基于功能化磁性纳米颗粒的肝炎核酸分子提取及扩增首先针对不同来源的两种乙肝核酸提取方法提取效果进行比较分析,并对提取出来的乙肝核酸样品进行验证性实验分析。结果发现,血清肝炎病毒核酸提取量虽少,但可以应用于PCR扩增,而应用于全基因组扩增效果较差。与此同时,全血中核酸提取量较高,一方面可以用于PCR扩增,还可应用于全基因组扩增技术,这样就起到了对肝炎核酸分子富集放大的作用。经过全基因组扩增的全血乙肝核酸DNA还可以进行PCR扩增。本章还对全血乙肝核酸DNA的全基因组扩增条件进行优化分析,这为今后利用化学发光的高通量多样本测定乙肝分子检测打下了基础。3.基于纳米磁分离和化学发光的乙肝PCR扩增检测方法的建立及优化本章以生物素标记的乙肝HBV DNA为目标分子,建立了一种乙肝核酸分子的化学发光杂交检测方法,结果表明,该方法的特异性较好。通过对检测体系中涉及到的多种实验条件进行优化处理,对整个检测方法有了更深入的了解,并得出了最优化的实验条件,有望提高该方法的检测灵敏度。优化的实验条件如下:最佳颗粒含量为100 μg;SA修饰MNPs的最佳浓度为0.1 mM;氨基化探针的最佳修饰浓度为2 μM;最佳杂交温度为45℃;最佳杂交时间为30 min;该方法在低浓度范围10-10000 copies/mL内,信号强度呈线性关系,检测灵敏度达 10copies/mL。4.基于纳米磁分离和化学发光的乙肝全基因扩增检测方法的建立及优化以磁珠法全血乙肝提取DNA做模板,同时以HBV基因探针为内标,进行生物素标记的包含乙肝HBV的全血全基因组扩增,从而建立了一种乙肝核酸全基因扩增标记的化学发光杂交检测方法。通过全基因组扩增技术进行乙肝HBV的化学发光检测,有利于进一步提高该方法的检测灵敏度。结果表明,该方法的特异性较好,化学发光的杂交效率有较大的提高,优化实验条件结果如下:最佳颗粒含量为80μg;SA修饰MNPs的最佳浓度为0.1 mM;氨基化探针的最佳修饰浓度为100 μM；最佳杂交时间为40 min。5.基于环介导等温扩增（LAMP）和化学发光的病毒检测方法目前临床上用于病毒检测的方法有很多,如聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光定量PCR（real-time qPCR）、酶联免疫吸附（ELISA）以及化学发光（CL）检测等。在这些检测技术中,基于核酸杂交的化学发光检测技术已经被广泛应用于检测乙肝、丙肝和艾滋病毒的临床检测。然而传统化学发光检测不仅需要通过聚合酶链反应（PCR）来得到有效的目标DNA,以便用于杂交,也需要长时间复杂的热循环过程和昂贵的实验仪器,这些方面的不足使得这一方法并不适合于医疗条件相对较低的社区医院或现场检测等情况。环介导等温扩增技术（LAMP）能够让核酸在等温的条件下快速且高特异性地进行核酸扩增,避免了 PCR长时间复杂的热循环过程和昂贵的实验仪器。本论文探索了一种基于逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）和化学发光相结合的办法检测RNA病毒。在LAMP扩增中加入biotin-11-dUTP使扩增产物带上生物素标记,再经过与特异性探针杂交,最后利用ALP-AMPPD化学发光反应体系判断样本中是否含有病毒核酸,以达到病原体检测目的。本论文优化了 LAMP扩增和探针杂交的相关条件,如LAMP反应温度、杂交时间、杂交温度、探针浓度等。确定了反应温度为65℃和61℃时对HBV和HCV基因的扩增效率最佳;探针浓度为10 μM,杂交时间为50 min时,对于HBV和HCV探针杂交效果最佳;然而,HBV基因最佳杂交温度为45℃,HCV探针的最佳杂交温度也为45℃。最后,通过灵敏度检测实验,我们得到本方法可以检测出103拷贝/mL的HCV-DNA和HCV-RNA。本方法相比于传统的基于PCR的化学发光检测,检测时间缩短了近1 h。此方法因基于LAMP扩增和核酸杂交,故在核酸检测方面具有高度特异性。此方法简化了检测过程,更容易实现自动化,因此在临床和现场筛查上有着广泛的应用前景。6.功能化PS微球在乙型肝炎病毒表面抗原的分子检测应用探索研究制备了一种新型的、无皂乳液聚合技术,制备了粒径合理（约400 nm）的单分散氨基官能化聚合物微球。通过扫描电子显微镜（SEM）、Zeta电位和傅立叶变换红外光谱仪（FT-IR）等各种表征方法表明,氨基基团已成功地引入到聚苯乙烯的微球表面,而且所制备的氨基化微球具有均匀的尺寸和良好的分散性等特性。随后通过将这种功能化微球固定化单克隆抗体并富集成功,从而以制备的功能化微球作为载体建立了一种基于化学发光酶联免疫分析法（ELISA）方法应用于乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的分子检测新技术。这种新的化学发光ELISA检测证明具有较好的特异性,且在使用ALP-AMPPD特定的化学发光系统中HBsAg的分子检测灵敏度较高。
程相蕾[3]（2007）在《猪胸膜肺炎放线杆菌血清抗体快速检测试剂盒的研制及应用》文中认为1 rApxⅣ-ELISA反应条件的优化和试剂盒的研制重组ApxⅣ蛋白表达与提纯经过改进，诱导转速由190rpm提高到220rpm：对早期经建立的检测猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）野毒感染抗体的rApxⅣ-ELISA进行了反应条件的优化，封闭液使用1％BSA在37℃封闭2h。底物溶液中的H2O2工作浓度从0.025‰降低到0.020‰，显色时间控制在8～10min。在此基础上组装成检测APP抗体的试剂盒可在-20℃保存12个月。该试剂盒的批次内和批次间的变异系数分别为3.2～6.9％和0.1～6.4％，具有特异性、敏感性良好的特点，可快速检测APP的ApxⅣ抗体水平的效果。2 rApxⅣ-IHA方法的建立利用大肠杆菌表达的APP的rApxⅣ主要结构蛋白，建立rApxⅣ—IHA检测猪的抗体。致敏绵羊血红细胞的蛋白浓度为15μg／mL，以pH4的TAP缓冲液作为致敏稀释液，37℃水浴1h致敏。IHA采用30μl体系，37℃，作用45min．1∶8孔全凝时判定为阳性，用此方法与本试验室先期建立的rApxⅣ—ELISA方法共同检测血清，328份呈线性正相关，相关系数为0.974。3 rApxⅣ-IHA试剂盒的研制和实际应用对建立的检测rApxⅣ抗体的IHA进行进一步的优化，并组装成ApxⅣ-IHA试剂盒，该试剂盒重复试验批间变异系数为0～6.4％；而批内变异系数为0～6.8％，4℃保存可达6个月。实际应用中，该rApxⅣ-IHA试剂盒检测猪血清阳性率32.0％（176／550），其中人工感染猪血清rApxⅣ—IHA检测阳性率达到92.2％：在检测的猪场中，其中1个6.1％的阳性率；而其余4个猪场阳性率为27.6～45.0％。以上结果表明rApxⅣ—IHA检测方法具有简便、快速和特异性强的特点，适于基层快速定性检测。
孙洋[4]（2007）在《肠出血性大肠杆菌O157快检方法的研究》文中研究表明肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157:H7感染性腹泻已逐渐成为威胁人群健康的重要公共卫生问题。完善检测手段是进行该病流行病学调查以及疾病防控的关键问题之一。本研究以stx1、stx2、eae和filC为靶基因建立了EHEC O157:H7 Mul-PCR检测方法,同时优化了选择性增菌培养基,提高了检测的敏感性。进而装备成试剂盒,便于储存和应用。对各种模拟样品和100份肉牛粪便样品进行了检测,证明具有高度的敏感性和特异性。随后针对EHEC O157毒力基因的特异性片段,设计了引物和探针,建立了基于TaqMan探针技术的实时荧光定量PCR检测方法,在定性检测的基础上,能够进一步测定检测样品目的菌的污染程度,评价风险强度。为进一步完善检测方法,本试验还建立了抗O157表面抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株,该细胞株分泌抗体特异性强,亲和力高,可用于EHEC O157免疫学检测方法的建立。以其建立的免疫磁性分离方法,用于样品的集菌,将PCR检测的敏感性提高了两个数量级。并用特异性单克隆抗体及兔抗O157多克隆抗体制备了EHEC O157胶体金免疫层析检测试纸条,敏感性为106CFU/mL。具有操作简便、快速、结果准确、易于判读的特点,可用于大量样品的检测。本研究形成一套系统的检测方法,为EHEC O157的流行病学研究及其疾病防控提供了坚实的技术支持。
高巍[5]（2007）在《猪链球菌2型单克隆抗体的制备及免疫学检测方法的建立》文中认为猪链球菌2型是一种重要的人畜共患病病原。因而建立高效、灵敏、特异的检测方法对及时控制治疗猪链球菌病具有极其重要的意义。本研究从四川省某发病猪场无菌采集病料,通过对分离菌株形态学观察、培养特性观察、生化试验、PCR检测、动物致病性试验,获得5株猪2型链球菌,并且5株2型菌都有毒力因子MRP和EF,其中S1株、S2株和S5株对BALB/C小鼠有致死性,另2株S3株和S4株对BALB/C小鼠无致病性。利用猪链球菌2型标准株CVCC606全菌作为免疫抗原,经甲醛灭活免疫BALB/C雌性小鼠,取脾进行融合。用提纯的标准菌株CVCC606的荚膜多糖筛选阳性杂交瘤细胞,共筛选出两株抗猪链球菌2型的单克隆抗体G5和C10。单克隆抗体经亚类鉴定,G5和C10均为IgG1型。特异性实验表明G5和C10不与八种猪常见病的细菌性病原体发生交叉反应,但与分离到的5株猪2型链球菌均发生交叉反应。以已制备出的抗猪链球菌2型单克隆抗体G5为基础,建立了双抗夹心间接ELISA法,同时对相关条件进行了优化,并且用此方法对实际样本进行检测,检测出8份血清为阳性,1份血清为阴性。双抗夹心间接ELISA法的建立为猪链球菌2型检测试剂盒的开发奠定了基础。
王卓[6]（2007）在《仔猪大肠杆菌病基因工程菌株GE-3的构建与免疫原性研究》文中研究表明新生仔猪大肠杆菌性腹泻（Diarrhea in Neonatal Swine Caused by E.coli）俗称仔猪黄痢,是由特定血清型产肠毒素性大肠埃希氏菌（Enterotoxigenetic E.coli,ETEC）感染所引起的初生仔猪的一种急性、致死性传染病。主要发生于一周龄以内的仔猪,尤以1-3日龄最为多见,临床以腹泻、排黄色稀便为主要特征,发病率和死亡率均很高。在仔猪腹泻病病原中,约有40%的病例由ETEC引起,而在我国则约为35%。ETEC的毒力因子主要包括黏附素（adhesin）和肠毒素（enterotoxin,Ent）。许多学者先后证实,多数ETEC菌株带有K88、K99、987P和F41等黏附素,并产生ST/LT或ST和LT。具有K88菌毛的菌株通常产生ST和LT,而具有K99、987P、F41等菌毛和不具有菌毛的菌株通常只产生ST。本研究应用分子生物学技术,针对新生仔猪大肠杆菌性腹泻病原的主要致病因子K88ac、ST1、LTB克隆和连接,并于原核载体中得以表达。表达的K88ac-ST1-LTB融合蛋白能被K88ac抗体、ST1和LTB单克隆抗体识别,并使免疫小鼠和仔猪抵抗强毒C83902株的攻击。用重组PCR技术对ETEC C83902株ST1基因的抗原编码区进行了定点突变,然后将突变后的三个ST1突变基因进行了连接,并克隆至中间载体质粒pUC19中,构建成重组质粒pXST3。用重组PCR技术对ETEC C83902株K88ac基因和LTB基因的抗原编码区分别克隆至中间载体质粒pBluescriptII和表达载体pET-28b中,构建成重组质粒pXK88和pXLT。在构建了上述三个中间质粒之后,经酶切、连接、克隆,构建了重组表达质粒pXK88acST3LT5。将其转化至工程菌株BL21（DE3）构建了重组菌株GE-3,其表达的融合蛋白经检测能够被K88ac抗体、ST1和LTB单克隆抗体识别。用乳糖替代IPTG对重组菌株GE-3进行诱导对比试验和诱导条件试验,证明乳糖可以替代IPTG诱导该重组菌株表达。用重组菌株GE-3乳糖诱导表达的菌液制备疫苗2批,分别用小鼠和猪进行了安全性试验和免疫攻毒试验,结果,2批疫苗均安全、有效。
陈华美[7]（2006）在《血清型1，2，6，7胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立及应用》文中进行了进一步梳理胸膜肺炎放线杆菌是引起猪出血性、纤维素性胸膜肺炎的高度传染性致死性病原菌，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。由于胸膜肺炎放线杆菌血清型多且各个血清型交叉保护弱，给本病的预防和控制带来了巨大困难。本试验根据胸膜肺炎放线杆菌种特异性外膜脂蛋白基因（OmlA）和血清型1，2，6，7荚膜多糖生物合成基因（CPS）分别设计引物，建立各单重PCR并优化条件，然后在此基础上建立多重PCR，对其特异性和敏感性进行检测，并应用于临床病料检测。 1 引物设计 参考GenBank中胸膜肺炎放线杆菌OmlA基因和CPS基因序列，分析其同源性，用Array Designer2.0软件针对OmlA两端保守基因，血清型1，2，6，7 CPS特异性区域分别设计引物，并对设计出的引物进行二聚体、同源性，互补性分析，同时对扩增序列进行同源性和互补性分析，确定5对引物，预扩增OmlA 952bp，CPS1 630bp，CPS2 504bp，CPS6 720bp，CPS7 389bp片段。 2 单重PCR 利用设计的引物分别对OmlA基因，血清型1，2，6，7 CPS基因进行PCR扩增，优化Tm值，引物浓度，Mg2+离子浓度，并对敏感性和特异性进行检测。结果在如下体系10×buffer(Mg2+-Free)5μl，25mM Mg2+ 3μl-6μl，2.5mM dNTP4μl，25／2pmol／ul上下游混合引物1.5μl-3μl，5u／μl Taq DNA聚合酶0.4μl，DNA模板5ul，最后用无菌去离子水补至50μl；反应程序为94℃预变性4min，94℃变性45s，52℃-58℃之间复性45s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存中都能扩增出预期的OmlA 952bp，CPS1 630bp，CPS2 504bp，CPS6 720bp，CPS7 389bp片段。对APP血清型1-4，6-10进行扩增，OmlA-PCR均能扩增出953bp片段，CPS1，CPS2，CPS6，CPS7 PCR分别只能扩增出预期的相应片段；对猪副嗜血杆菌、猪肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、肠炎沙门氏菌、猪链球菌、大肠杆菌和猪丹毒杆菌进行扩增，各PCR均不能扩增出任何片段。对各PCR敏感性进行检测，均能扩增出10pg的DNA量。 3 多重PCR 在单重PCR基础上，通过优化退火温度，引物浓度，镁离子浓度，建立即可对APP进行定性检测又同时可对APP血清型1，2，6，7进行定型检测的多重PCR方法。其优化的体系为10×buffer(Mg2+-Free)5μl，25mM Mg2+ 4μl，2.5mM dNTP 4μl，25pmol／ul OmlA上下游混合引物2μl，其它型上下游混合引物各1.5ul，5u／μl Taq DNA聚合酶0.3μl，DNA模板5ul，最后用无菌去离子水补至50μl；反应程
肖国生[8]（2006）在《胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体和多杀性巴氏杆菌基因芯片检测与分型研究》文中研究表明基因芯片技术能在单一检测中从种、亚种、型和亚型水平上同时鉴定多种病原，为多病原联合检测和病原分型提供了一项新技术。基因芯片技术具有敏感性高，特异性强、高通量和平行性的优点。本研究对胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体和多杀性巴氏杆菌的检测和分型靶基因进行了设计，以PCR方法扩增出用于三种细菌联合检测和胸膜肺炎放线杆菌分型的靶基因，并建立了检测三种细菌和胸膜肺炎放线杆菌基因分型的基因芯片。建立的APP-Mhp-PM检测基因芯片和APP分型基因芯片是一种新的检测技术，将对监测、联合诊断和防治这三种猪呼吸道细菌病发挥重要作用。 根据胸膜肺炎放线杆菌的16S rDNA、apxⅣA、dsbE、omlA、apx和荚膜多糖（cp）基因，猪肺炎支原体的16S rDNA和P36蛋白基因，多杀性巴氏杆菌的psl和KMT1基因，入噬菌体DNA共设计和选用了23对引物，除选用引物外，其它引物由Arraydesigner 2.0软件设计。用23对引物共扩增出25个不同靶基因，并克隆到pMD18-T载体中。其中7个检测靶基因：胸膜肺炎放线杆菌3个（apxⅣ、dsbE、A16S），猪肿炎支原体2个（M16S、P36），多杀性巴氏杆菌2个（psl、KMT1）；17个用于胸膜肺炎放线杆菌分型的靶基因：omlA1、omlA2、omlA3、omlA4、cps1、cps2、cps6、cps7、cps8、cpx3、cpx6、cpx9、apxⅠA、apxⅠD、apxⅡA、apxⅢA和apxⅢD；一个定位靶基因λDNA。对克隆的25个靶基因质粒进行了序列测定和序列比对。结果发现，靶基因A16S与放线杆菌属内所有放线杆菌的16SrRNA的同源性均在95％以上，靶基因M16S与猪肺炎支原体、絮状支原体和猪鼻支原体的16SrRNA的同源性分别为100％、95％和88％；靶基因apxⅣ、dsbE、P36、KMT1和psl与各自不同型或株的相同基因序列的同源性均在92％以上。除分型靶基因apxⅠD和apxⅢD序列间的同源性在75％外，其它分型靶基因序列间的同源性均在67％以下。 用7个检测靶基因制备APP-Mhp-PM检测基因芯片，选用omlA1、omlA2、omlA3、omlA4、cps1、cps2、cps6、cps7、cps8、cpx6、apxⅠA、apxⅠD、apxⅡA、apxⅢA和apxⅢD 15个分型靶基因制备APP分型基因芯片。靶基因A16S、dsbE和apxⅣ联合检测胸膜肺炎放线杆菌；靶基因M16S和36联合检测猪肺炎支原体；靶基因psl和KMT1联合检测多杀性巴氏杆菌。15个分型靶基因的不同组合用于胸膜肺炎放线杆菌的基因分型。用基因芯片点样仪SpotArray 24将异丙醇沉淀法制备的浓度在250～300 ng／μl的
李秉鸿[9]（2000）在《免疫磁化分离法检测猪链球菌》文中进行了进一步梳理 加拿大的M.Gottschalk等采用了免疫磁化分离技术（IMS）对猪链球菌的2型和1/2型株进行检测。他们将一种超顺磁性聚苯乙烯珠（IMB）包被纯化的含被膜涎酸表位的单克隆抗体（MAb）或包被纯化的兔免疫球蛋白G（多克隆抗体PAb）。两者对2型株和1/2株都具特异性,但两者又有区别,使用MAb-IMS时包被IMB的抗体量、最适细菌恢复要求的IMB数,以及非特异性遗留都明显高于PAb-IMS,IMS技术的灵敏度是
二、免疫磁化分离法检测猪链球菌（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、免疫磁化分离法检测猪链球菌（论文提纲范文）
（1）肠出血性大肠杆菌O157:H7的IMS-RT-PCR和镧系荧光微球免疫层析检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号与缩略语 |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 肠出血性大肠杆菌EHEC O157:H7的研究进展 |
| 1 大肠杆菌简介 |
| 1.1 大肠杆菌的生物学特性 |
| 1.2 大肠杆菌的抗原分类 |
| 1.3 大肠杆菌的致病性 |
| 1.4 肠出血性大肠杆菌简介 |
| 1.5 肠出血性大肠杆菌O157:H7感染的传播途径与临床表现 |
| 1.6 肠出血性大肠杆菌O157:H7分离检测的方法 |
| 2 本研究的目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验部分 |
| 第二章 抗EHEC O157:H7 O-SP单克隆抗体的制备 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验菌株 |
| 1.3 试验试剂 |
| 1.4 试验仪器 |
| 1.5 EHEC O157:H7菌体抗原的制备 |
| 1.6 包被原EHEC O157:H7 O-特异性多糖(O-SP)的制备 |
| 1.7 动物免疫程序及抗体效价测定 |
| 1.8 抗EHEC O157:H7单克隆的制备 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 EHEC O157:H7 O-SP的提取 |
| 2.2 免疫鼠多克隆抗体的效价测定 |
| 2.3 细胞融合后效果评估 |
| 2.4 分泌特异性抗体的阳性克隆筛选 |
| 2.5 阳性细胞株的亚克隆与冻存 |
| 2.6 单克隆抗体的特性分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 采用IMS-RT-PCR方法快速检测肉制品中EHEC 0157:H7 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验试剂 |
| 1.2 试验菌株 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 纳米磁珠标记单克隆抗体时的条件优化 |
| 2.2 免疫磁珠性能的测定 |
| 2.3 IMS-RT-PCR检测方法的建立 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 制备镧系荧光微球免疫层析试纸条快速检测EHEC O157:H7 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验仪器 |
| 1.3 试验相关溶液配制 |
| 1.4 试验原理 |
| 1.5 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 试纸条各个参数的优化 |
| 2.2 试纸条的性能测定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 个人简历、攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（2）基于纳米磁分离和化学发光的肝炎分子检测新技术研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 磁性纳米颗粒 |
| 1.1.1 磁性纳米颗粒的性质 |
| 1.1.2 磁性纳米颗粒的制备方法 |
| 1.2 化学发光技术 |
| 1.2.1 化学发光免疫分析技术的基本原理 |
| 1.2.2 化学发光免疫分析法的类型 |
| 1.2.2.1 化学发光免疫分析 |
| 1.2.2.2 化学发光酶免疫分析 |
| 1.2.2.3 电化学发光免疫分析 |
| 1.2.3.4 其他化学发光体系 |
| 1.3 肝炎的分子生物学鉴定方法 |
| 1.3.1 实时荧光PCR技术 |
| 1.3.2 基因芯片技术 |
| 1.3.3 荧光显微镜检测 |
| 1.3.4 基于纳米材料的生物传感器技术 |
| 1.3.5 基于Luminol-H_2O_2-HRP化学发光体系的分子检测 |
| 1.4 磁性纳米颗粒在分子检测研究的研究进展 |
| 1.5 核酸体外扩增检测技术 |
| 1.5.1 PCR扩增技术 |
| 1.5.2 等温扩增技术 |
| 1.5.3 全基因组扩增技术 |
| 1.6 问题与展望 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 1.7.1 研究目的 |
| 1.7.2 研究意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 Fe_3O_4磁性纳米颗粒的制备与性能表征 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验试剂与仪器 |
| 2.2.1.1 实验试剂 |
| 2.2.1.2 实验仪器 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 Fe_3O_4磁性纳米颗粒的制备 |
| 2.2.2.2 Fe_3O_4@SiO_2磁性纳米颗粒的制备 |
| 2.2.2.3 磁性纳米颗粒的表征 |
| 2.2.2.4 以Fe_3O_4@SiO_2纳米粒子为吸附剂从大肠杆菌中分离核酸 |
| 2.2.2.5 PCR验证实验 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 TEM分析 |
| 2.3.2 扫描电镜分析(SEM) |
| 2.3.3 Fe_3O_4/SiO_2磁性纳米颗粒的FT-IR光谱图 |
| 2.3.4 Fe_3O_4/SiO_2磁性纳米颗粒的磁滞回归曲线 |
| 2.3.5 磁性纳米颗粒的粒径分析 |
| 2.3.6 核酸提取的初步尝试 |
| 2.3.7 PCR验证分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 FE3O4@SIO2磁性纳米颗粒在不同来源的DNA提取中的应用研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 基于磁分离提取全血DNA基本步骤 |
| 3.3.2 基因组DNA的提取与测定 |
| 3.3.3 基于MNPs的不同来源DNA的PCR验证 |
| 3.3.3.1 从大肠杆菌JM 109中提取基因组DNA的16SrDNA基因PCR扩增 |
| 3.3.3.2 从酵母中提取基因组DNA的18SrDNA基因PCR扩增 |
| 3.3.3.3 全血基因组DNA GADPH基因的PCR扩增 |
| 3.3.3.4 HBV DNA的PCR扩增实验 |
| 3.3.4 限制性酶切鉴定分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 从不同来源提取基因组DNA |
| 3.4.2 PCR验证实验 |
| 3.4.3 限制性内切酶法分析提取的基因组核酸 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 基于磁性复合颗粒的化学发光乙肝核酸检测方法研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验试剂与仪器 |
| 4.2.1.1 实验试剂 |
| 4.2.1.2 实验仪器及耗材 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.2.1 HBV-DNA的磁性颗粒提取法 |
| 4.2.2.2 化学发光检测 |
| 4.2.2.3 生物素MDNA片段的谓 |
| 4.2.2.4 最佳磁性复合颗粒用量 |
| 4.2.2.5 磁性颗粒的最佳羧基化浓度修饰实验 |
| 4.2.2.6 最佳探针修饰浓度实验 |
| 4.2.2.7 最佳杂交时间的实验 |
| 4.2.2.8 不同浓度扩增产物的检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 扩增序列的凝胶电泳图片 |
| 4.3.2 特异性检测 |
| 4.3.3 磁性纳米颗粒用量的影响 |
| 4.3.4 羧基化浓度的影响 |
| 4.3.5 探针浓度对化学发光强度的影响 |
| 4.3.6 杂交时间对化学发光的影响 |
| 4.3.7 梯度稀释的扩增产物的检测 |
| 4.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 基于磁性纳米颗粒和全基因组扩增的全血化学发光检测技术研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验试剂与仪器 |
| 5.2.1.1 实验材料 |
| 5.2.1.2 实验仪器 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.2.2.1 全血DNA提取实验 |
| 5.2.2.2 全基因组扩增(WGA)与生物素dUTP标记 |
| 5.2.2.3 WGA产物凝胶电泳 |
| 5.2.2.4 HBV基因探针与MNPs的结合 |
| 5.2.2.5 HBV基因的化学发光检测实验 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 全血基因组DNA的提取 |
| 5.3.2 序列特异性HBV DNA的检测实验 |
| 5.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 基于环介导等温扩增(LAMP)及化学发光技术的乙肝和丙肝的分子检测方法研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料与仪器 |
| 6.2.2 实验方法 |
| 6.2.2.1 HBV-DNA和HCV-RNA提取 |
| 6.2.2.2 LAMP和RT-LAMP扩增及琼脂糖凝胶电泳验证 |
| 6.2.2.3 HBV和HCV基因化学发光检测 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 HBV-DNA和HCV-RNA提取 |
| 6.3.2 LAMP扩增温度优化 |
| 6.3.3 HBV和HCV基因化学发光检测 |
| 6.3.4 探针浓度对化学发光的影响 |
| 6.3.5 杂交温度对化学发光的影响 |
| 6.3.6 杂交时间对化学发光的影响 |
| 6.3.7 灵敏度检验 |
| 6.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第七章 基于聚苯乙烯纳米颗粒和化学发光的乙肝表面抗原的分子检测方法研究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 化学试剂和材料 |
| 7.2.2 主要试剂 |
| 7.2.3 实验仪器 |
| 7.2.4 实验方法 |
| 7.2.4.1 氨基功能化聚苯乙烯微球的制备 |
| 7.2.4.2 醛基化聚苯乙烯微球的制备 |
| 7.2.4.3 免疫聚苯乙烯纳米颗粒的制备 |
| 7.2.4.4 免疫聚苯乙烯纳米颗粒的非特异性处理封闭 |
| 7.2.4.5 乙型肝炎表面抗原的免疫检测 |
| 7.2.4.6 灵敏性检测实验 |
| 7.3 表征 |
| 7.3.1 颗粒形态 |
| 7.3.2 表面化学分析 |
| 7.4 结果与讨论 |
| 7.4.1 氨基化PS微球的制备 |
| 7.4.2 PS微球的表面特性 |
| 7.4.3 功能化的PS微球和化学发光法检测乙型肝炎表面抗原 |
| 7.4.4 特异性实验 |
| 7.4.5 检测限的确定 |
| 7.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第八章 总结与展望 |
| 8.1 论文总结 |
| 8.2 下一步工作需要解决的问题 |
| 博士期间的科研成果 |
| 致谢 |
（3）猪胸膜肺炎放线杆菌血清抗体快速检测试剂盒的研制及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 1.病原学 |
| 2.流行病学 |
| 3.胸膜肺炎放线杆菌的诊断 |
| 4.免疫与预防 |
| 5.毒力因子的研究状况 |
| 6.检测技术的研究与进展 |
| 7.APP基因分型方法的研究进展 |
| 8.参考文献 |
| 第二篇 试验部分 |
| 第一章 rApxⅣ-ELISA反应条件的优化与试剂盒的研制 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第二章 rApxⅣ-IHA方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第三章 rApxⅣ-IHA试剂盒的研制和实际应用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 附录:常用试剂 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（4）肠出血性大肠杆菌O157快检方法的研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 EHEC 0157 毒力因子及致病机制 |
| 1 志贺毒素 |
| 2 LEE 致病岛 |
| 3 其他致病岛 |
| 4 其他黏附机制 |
| 5 pO157 质粒 |
| 6 结语 |
| 第二章 EHEC O157 感染的流行病学与防控 |
| 1 动物宿主 |
| 2 生态学 |
| 3 新出现的传播方式 |
| 4 防控策略 |
| 5 研制中的菌苗 |
| 6 结语 |
| 第三章 EHEC O157 的检测 |
| 1 常规检测方法 |
| 2 免疫学检测方法 |
| 3 分了生物学检测方法 |
| 4 结语 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 EHEC O157 多重PCR 快检试剂盒的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 EHEC O157 定量PCR 快速检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 EHEC O157 单克隆抗体细胞株的建立和特性分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 EHEC O157 免疫磁性分离方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 EHEC O157 胶体金免疫层析检测试纸条的研制 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文及其他成果 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| CURRICULUM VITAE |
（5）猪链球菌2型单克隆抗体的制备及免疫学检测方法的建立（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 猪链球菌2 型致病因子的研究进展 |
| 1 猪链球菌2 型致病因子 |
| 2 猪链球菌2 型致病机制 |
| 第二章 猪链球菌2 型检测方法的研究进展 |
| 1 免疫学检测方法研究进展 |
| 2 分子生物学检测方法研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 猪链球菌2 型的分离与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 猪链球菌2 型单克隆抗体的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 猪链球菌2 型ELISA 检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
（6）仔猪大肠杆菌病基因工程菌株GE-3的构建与免疫原性研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 新生仔猪大肠杆菌性腹泻病原（ETEC）致病因子研究进展 |
| 1 菌毛(黏附素) |
| 2 肠毒素 |
| 3 小结 |
| 第二篇 研究内容 仔猪大肠杆菌病基因工程菌株GE-3 的构建与免疫原性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 硕士期间发表论文情况 |
| CURRICULUM VITAE |
（7）血清型1，2，6，7胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立及应用（论文提纲范文）
| 论文独创性声明 |
| 关于论文使用授权的声明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 文献综述 |
| 目的意义 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 文章发表 |
（8）胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体和多杀性巴氏杆菌基因芯片检测与分型研究（论文提纲范文）
| 文献综述 |
| 一 基因芯片技术及其在病原微生物检测和分型中的应用 |
| 二 胸膜肺炎放线杆菌研究进展 |
| 三 猪肺炎支原体研究进展 |
| 四 多杀性巴氏杆菌诊断和分子生物学 |
| 前言 |
| 第一章 APP-Mhp-PM检测基因芯片和APP分型基因芯片的靶基因克隆和鉴定 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第二章 APP-Mhp-PM检测基因芯片和APP分型基因芯片的构建 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第三章 APP-Mhp-PM检测基因芯片和APP分型基因芯片应用研究 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 彩图 |
| 附件1 试验试剂配置 |
| 附件2 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
四、免疫磁化分离法检测猪链球菌（论文参考文献）
- [1]肠出血性大肠杆菌O157:H7的IMS-RT-PCR和镧系荧光微球免疫层析检测方法的建立[D]. 龙梦瑶. 南京农业大学, 2018(07)
- [2]基于纳米磁分离和化学发光的肝炎分子检测新技术研究[D]. 马超. 东南大学, 2018(12)
- [3]猪胸膜肺炎放线杆菌血清抗体快速检测试剂盒的研制及应用[D]. 程相蕾. 南京农业大学, 2007(05)
- [4]肠出血性大肠杆菌O157快检方法的研究[D]. 孙洋. 吉林大学, 2007(03)
- [5]猪链球菌2型单克隆抗体的制备及免疫学检测方法的建立[D]. 高巍. 吉林大学, 2007(03)
- [6]仔猪大肠杆菌病基因工程菌株GE-3的构建与免疫原性研究[D]. 王卓. 吉林大学, 2007(02)
- [7]血清型1，2，6，7胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立及应用[D]. 陈华美. 四川农业大学, 2006(12)
- [8]胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体和多杀性巴氏杆菌基因芯片检测与分型研究[D]. 肖国生. 四川农业大学, 2006(12)
- [9]免疫磁化分离法检测猪链球菌[J]. 李秉鸿. 畜牧兽医科技信息, 2000(01)