一、大鼠急性脊髓损伤后细胞凋亡的时空分布特点（论文文献综述）
吴子健[1]（2021）在《通腑逐瘀法指导下抵当汤加减调控AQP4表达治疗大鼠急性脊髓损伤的作用机制研究》文中进行了进一步梳理目的 本次研究结合急性脊髓损伤（acute spinal cord injury,ASCI）的研究现状和热点,基于导师的临床经验,以通过抑制水通道蛋白4（aquaporin 4,AQP4）的表达从而减轻ASCI后脊髓水肿为切入点,旨在探讨通腑逐瘀法治则指导下抵当汤加减治疗ASCI的可能作用机制,以期为推广通腑逐瘀法治疗ASCI提供理论依据。方法 第一部分:10周龄SD大鼠30只,按随机数字表法随机分为假手术组（A组）、自制打击器2cm组（B1组）、自制打击器4cm组（B2组）、NYU组1.25cm组（C1组）、NYU组2.5cm组（C2组）,每组各6只。除Sham组外,其余各组采用改良Allen’s法造模。B1、B2组将9g打击杆分别从2cm、4cm处自由坠落撞击T10脊髓,C1、C2组使用NYU打击器分别从1.25cm、2.5cm处撞击T10脊髓。各组造模完成后分别于1、3、5、7d进行BBB评分和Reuter评分,7d后行灌注取材,石蜡包埋切片,尼氏染色,观察各组组织受损程度和神经元存活率。第二部分:10周龄SD大鼠60只按随机分配方法随机分为假手术组（Sham）、模型组（Model）、抵当汤组（DDD）、TGN-020组（TGN-020）和抵当汤联合TGN-020组（DDD+TGN-020）,每组各12只。Sham组仅打开椎板暴露脊髓但不损伤脊髓;其余各组均采用自制脊髓打击器从40mm高度对脊髓进行打击。Sham组和Model组术后不予任何治疗措施干预,DDD组于术后3d予以抵当汤加减每日灌胃,持续3d,根据大鼠与人用药剂量体表面积换算法,DDD组大鼠每日用药剂量为5.04g/kg,采用蒸馏水进行稀释一定比例配制后予以灌胃处理,每日早晚各1次。TGN-020组处理方法:腹腔注射给药,每日用药剂量为5mg/kg,给药时间为3d。DDD+TGN-020组处理方法:予TGN-020腹腔注射给药,随后给予DDD灌胃处理。干预结束后进行行为学评价（BBB评分、斜板实验及Reuter评分）观察大鼠神经功能恢复情况,取材后进行脊髓组织大体观察和含水率检测、HE染色观察组织受损程度,尼氏染色观察神经元形态,免疫荧光检测各组脊髓组织AQP4、GFAP共表达的阳性细胞个数,Western Blot法检测各组脊髓组织中AQP4、GFAP、CSPG、PCNA、NGF、BDNF、GAP-43蛋白的表达量,q PCR法检测各组脊髓组织中CSPG、PCNA基因的表达量,电镜下观察各组髓鞘和神经元组织形态,高尔基染色观察树突和树突棘形态。第三部分:8周龄SD大鼠40只随机分为空白血清组和含药血清组,含药血清组给予5.04g/kg DDD灌胃,持续3d,空白血清组予等剂量超纯水灌胃,持续3d,干预结束后提取血清备用。每次取胚胎大鼠8-12只,通过机械-酶消化法提取星形胶质细胞（Astrocytes,AS）,细胞采用10%的高糖培养基培养,观察细胞传代至第3代进行后续实验。首先,免疫荧光鉴定细胞中GFAP含量,随后进行实验分组:空白组（Control group,CG）、模型组（Model group,MG）、空白血清组（Blank serum group,BSG）、DDD含药血清组（DDD）、TGN-020干预组（TGN-020）、DDD联合TGN-020组（DDD+TGN-020）,除MG外,其余各组均以划痕法进行造模,造模完成后DDD予以含药血清干预,BSG予以等剂量空白血清干预,TGN-020予以100nm TGN-020干预,DDD+TGN-020先予TGN-020干预后再予DDD干预。MTT法检测DDD含药血清干预AS的安全干预浓度、最佳干预时间和干预浓度,MTT法检测各组对RAS活性的影响,免疫荧光染色法检测RAS中AQP4和GFAP共表达的细胞数,Western Blot法检测各组RAS中AQP4、GFAP和NGF、BDNF、GAP-43蛋白的表达量,镜下观察DDD含药血清对RAS迁移率的影响。统计学方法:实验所得数据均使用SPSS21.0软件进行统计学处理,计量资料以均值±标准误（`X±S）表示,所得数据均经过正态性分布检测,若符合正态分布,则采用单因素方差分析,方差齐则采用LSD法,方差不齐则采用Games-Howell法;若不符合正态分布,则采用非参检验。以P<0.05提示差异具有统计学意义。结果 第一部分:自制脊髓打击器与NYU打击器建立脊髓损伤模型研究1.各组脊髓外观形态比较A组T10节段处硬脊膜完整,脊髓组织呈均匀乳白色,形态饱满圆润;B1、B2、C1、C2组T10节段处硬脊膜均完整,颜色呈不同程度的鲜红色或暗红色,损伤处可见水肿、瘀血及瘢痕组织增生,相对于B1、C1组,B2、C2组水肿更严重、瘀血范围更广、颜色更深、瘢痕组织更多。2.行为学评分比较BBB评分结果显示,A组术后除因手术致运动量减少外,未出现双下肢功能异常的表现,评分为21分;其余各组均出现不同程度的运动功能障碍,具体表现为:B2与B1、C2与C1相比,BBB评分显着降低,差异具统计学意义（P<0.05）;B1与C1、B2与C2相比,BBB评分无显着差异（P>0.05）。Reuter评分结果显示,A组术后未发现感觉功能异常现象;其余各组术后均出现不同程度的感觉功能异常现象,具体表现为B2、C2组术后1d牵张反射消失,肌力、肌张力减弱或消失,疼痛回缩反射迟钝,背部感觉存在或消失;B1、C1组术后1d除肌力消失外,牵张反射、肌张力、疼痛回缩反射、背部感觉均存在,术后3d肌力开始恢复。B2与B1、C2与C1相比,Reuter评分显着降低,差异具统计学意义（P<0.05）。B1与C1、B2与C2相比,Reuter评分无显着差异（P>0.05）。3.尼氏染色尼氏染色结果显示,A组脊髓组织结构完整,灰白质边界清晰,神经元细胞形态规则、胞核大、核仁清晰可见、数量多,胞质内可见斑块样尼氏体。相比A组,其余各组结构破坏更严重,灰白质结构不清,组织空白间隙更大,损伤处可见细胞呈空泡样改变或细胞皱缩、体积减小,神经元数量减少,尼氏体模糊或消失。4.脊髓受损面积比结果表明,A组未见受损区域,比值为0,其余各组均高于A组,差异具有统计意义（P<0.05）;相对于B1和C1,B2和C2损伤面积比值明显升高,差异具有统计意义（P<0.05）;B1与B2、C1与C2损伤面积比值差异不具有统计意义（P>0.05）。5.各组脊髓前、后角神经元损伤程度比较通过分析前、后角神经元阳性细胞数结果显示,A组神经元数目多,尼氏体含量多,其余各组均少于A组,差异具有统计意义（P<0.05）;相对于B1和C1,B2和C2神经元阳性细胞数明显减少,差异具有统计意义（P<0.05）;B1与B2、C1与C2神经元阳性细胞数差异不具有统计意义（P>0.05）。第二部分:抵当汤加减调节AQP4表达对SCI大鼠脊髓水肿的作用研究1.各组脊髓组织的大体观察从大体观察上来看,Sham组脊髓组织颜色鲜白,组织完整,未见瘀血部位和水肿;Model组在打击损伤部位可见明显的瘀血区域,瘀血颜色深红,瘀血范围较大,并可见明显脊髓水肿;DDD组在打击损伤部位可见较小的瘀血区域,瘀血部位颜色淡红,可见轻度水肿;DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组大体观察相似,肉眼见无显着差异。2.各组脊髓组织含水率与Sham组相比,其余各组脊髓组织含水率均显着增高（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组脊髓组织含水率均显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组组间比较,脊髓组织含水率没有显着差异（P>0.05）。3.行为学观察结果各组大鼠BBB评分、斜板实验结果以及Reuter评分显示,与Sham组相比,其余各组BBB评分和斜板实验得分均显着降低（P<0.05）,Reuter评分均显着升高（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组BBB评分均显着升高（P<0.05）,Reuter评分均显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组组间比较无显着差异（P>0.05）。4.HE染色Sham组组织结构完整,神经元等细胞形态结构良好,未见瘢痕组织或空洞形成,未见瘀血区域或炎性物质渗出。Model组损伤部位可见组织结构离乱,大量瘢痕组织和脊髓空洞的形成,可见明显的瘀血区域,并伴有大量的炎性细胞浸润,神经元等细胞皱缩,数量减少。其余三组可见组织形态结构较完整,可见少量脊髓空洞的形成,瘀血区域范围较小,炎性细胞清润较少,神经元等细胞形态结构较完整。使用Image J软件对各组空洞面积进行定量分析,结果显示,与Sham组相比,Model组脊髓空洞面积显着增加（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组脊髓空洞面积显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组脊髓空洞面积组间比较不具有显着差异（P>0.05）。5.尼氏染色观察各组神经元形态Sham组脊髓形态结构完整,灰质呈蝴蝶状,灰白质界限清晰,可见较多的神经元分布,神经元胞质内可见染色清晰的斑块状尼氏体,神经元胞体饱满,细胞核大,核仁明显。Model组脊髓组织破坏严重,结构不完整,灰、白质界限不清,可见大量的炎性细胞浸润,神经元皱缩、液化、坏死,形成较多的空泡,尼氏体较小或消失。相对Model组,DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组脊髓结构较完整,隐约可见灰白质界限,神经元仍可见,数量较多,空泡样改变减少,尼氏体数量较多、较饱满。但相对于Sham组,神经元仍存在固缩,胞浆减少,核变小,尼氏体减少等病理改变。6.免疫荧光检测各组AQP4、GFAP的阳性细胞表达量AQP4阳性细胞表达呈绿色,GFAP阳性细胞表达呈红色,DAPI染色呈深蓝色,AQP4+/GFAP+细胞表达呈黄色树枝状,各组染色背景干净,表达清晰,细胞核数量无显着差异（P>0.05）,具有可比性。Sham组少见或未见明显的AQP4+/GFAP+细胞,Model组可见较多的AQP4+/GFAP+细胞,且细胞亮度高,胞体肿胀程度严重。与模型组相比,DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组细胞数量较少,亮度较低,细胞肿胀程度减轻。对各组的AQP4+/GFAP+细胞进行计数和统计,与Sham组相比,其余各组AQP4与GFAP的阳性细胞占比均显着增高（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组AQP4与GFAP的阳性细胞占比显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组间相比较,AQP4与GFAP的阳性细胞占比无显着差异（P>0.05）。7.Western Blot法检测各组AQP4、GFAP、PCNA、CSPG、NGF、BDNF、GAP-43的蛋白表达量各组蛋白条带背景清晰,无杂带现象,蛋白表达量趋势明显,具有可比性。与Sham组相比,各组脊髓组织中AQP4、GFAP、PCNA、CSPG蛋白的灰度值显着增高（P<0.05）,NGF、BDNF、GAP-43蛋白的灰度值显着降低（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组脊髓组织中AQP4、GFAP、PCNA、CSPG蛋白的灰度值显着降低（P<0.05）,NGF、BDNF、GAP-43蛋白的灰度值显着增高（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组组间比较结果显示,各组脊髓组织中AQP4、GFAP、PCNA、CSPG、NGF、BDNF、GAP-43蛋白的灰度值差异不具有统计学意义（P>0.05）。8.各组脊髓组织中PCNA和CSPG基因表达量各组基因检测的扩增曲线变化平稳,溶解曲线为平滑的单峰形态,说明引物设计好,模板未见污染,实验结果具有可比性。各组目的基因相对表达量结果显示,与Sham组相比,各组脊髓组织中PCNA、CSPG基因的表达量显着增高（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组脊髓组织中PCNA、CSPG基因的表达量显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组组间比较结果显示,各组脊髓组织中PCNA、CSPG基因的表达量差异不具有统计学意义（P>0.05）。9.透射电子显微镜观察髓鞘和神经元组织形态Sham组脊髓组织在透射电镜下可见髓鞘外形规则,厚薄均一,形似同心圆状,结构完整,未见破裂、缺失等改变,板层结构均匀致密,胞内线粒体丰富,胞浆饱满,清晰可见。Model组髓鞘结构不规则,部分髓鞘断裂缺失,厚薄不一,局部可见褶皱卷曲,板层结构松散、融合,线粒体肿胀,甚至部分溶解消失;DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组可见髓鞘结构较完整,形态部分不规则但较Model组改善,部分髓鞘可见卷曲、厚薄不一,板层结构较均匀,虽有部分缺失,但松散程度相对Model组较轻,仍可见清晰的线粒体,但数量较Sham组少,胞体较小。10.电镜观察树突和树突棘形态各组脊髓经高尔基染色后结果显示:Sham组脊髓树突结构完整、形态规则、长度较长,树突上密布树突棘,树突棘分布整齐、均匀致密、数量较多;Model组脊髓树突形态不规则,部分断裂缺失,长度较短,较为纤细,树突棘数量少,稀疏分布,排列紊乱;与Model组相比,DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组脊髓树突形态有所改善、树突较长、结构较完整、周经较粗,树突棘数量较多,排列更为规则、整齐。对各组脊髓树突长度及树突棘进行定量分析,结果显示,与Sham组相比,Model组树突长度明显降低（P<0.05）,树突棘数量明显减少（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组树突长度明显增加（P<0.05）,树突棘数量显着增多（P<0.05）;DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组组间相比,差异不具有统计学意义（P>0.05）。第三部分:抵当汤加减含药血清对反应性星形胶质细胞的活化、迁移及神经生长相关细胞因子分泌的作用1.原代AS镜下观察原代细胞培养2d,镜下可见AS细胞呈不规则形状散在分布,部分细胞形似星形,细胞核大、呈椭圆形,细胞胞浆丰富,从胞体向四周发出长而有分支的突起;将原代细胞传代至第三代可见细胞生长状态良好,适宜进行后续实验。2.AS鉴定免疫荧光染色结果显示,GFAP染色呈阳性,阴性对照组未见任何阳性染色,提示GFAP呈特异性表达,所提取的细胞为AS。3.DDD含药血清对AS的安全干预浓度,以及干预RAS的最佳干预时间和最佳干预浓度DDD含药血清干预AS的安全浓度范围为:0-15%,DDD含药血清干预RAS最佳的干预浓度为10%,最佳干预时间为48h。4.DDD含药血清对RAS活性的影响MTT结果显示,与CG组相比,其余各组RAS活性均降低（P<0.05）;与MG相比,BSG组RAS活性无显着差异（P>0.05）,DDD、TGN-020和DDD+TGN-020组RAS活性均显着下降（P<0.05）;DDD、TGN-020和DDD+TGN-020组间比较无显着差异（P>0.05）。5.DDD含药血清对RAS迁移率的影响损伤24h后,各组RAS与对侧细胞完全分离,中间形成一条空白的划痕区域,划痕区未见或少见RAS;48h后部分细胞开始向对侧延伸突触,划痕区域出现部分肥大的RAS,细胞胞浆丰富,胞体呈球形,发亮,细胞加速分裂;72h后划痕区域缩小,部分RAS与对侧RAS突触交织,划痕开始愈合。在整个愈合过程中,24h各组划痕区域面积比无显着差异（P>0.05）;自48h开始,与MG组相比,BSG划痕区域面积比无显着差异,其余各组均明显较大（P<0.05）。DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组组间比较无显着差异（P>0.05）。72h后,MG组与BSG组划痕区域面积比无显着差异（P>0.05）。与MG组相比,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组划痕区域面积比明显较大（P<0.05）,组间比较无显着差异（P>0.05）。以上划痕区域面积比的改变反映了RAS在损伤发生后向受损区域的迁移速率。6.各组对RAS中AQP4、GFAP荧光表达量的影响使用免疫荧光染色法对RAS中AQP4、GFAP和细胞核进行了标记。染色结果显示,AQP4+细胞呈绿色,GFAP+细胞呈红色,细胞核呈蓝色,荧光双标的细胞呈黄色的不规则树枝状。其中,CG组仅见12个零星分布的AQP4+/GFAP+细胞;MG组和BSG可见较多的AQP4+/GFAP+细胞,亮度较高,细胞肿胀程度严重;DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组可见较少的AQP4+/GFAP+细胞,亮度较低,细胞肿胀程度较轻。对AQP4+/GFAP+细胞进行计数统计,结果表明,与CG相比,其他各组阳性细胞占比显着增多（P<0.05）;与MG相比,除BSG组无显着差异外（P>0.05）,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组阳性细胞占比显着减少（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组阳性细胞占比组间相比无显着差异（P>0.05）。7.各组对RAS中AQP4、GFAP和NGF、BDNF、GAP-43蛋白表达量的影响结果显示,与CG组相比,其余各组AQP4和GFAP蛋白表达量均显着增高（P<0.05）,NGF、BDNF、GAP-43蛋白表达量均显着降低（P<0.05）;与MG组相比,除BSG组无明显差异外（P>0.05）,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组AQP4和GFAP蛋白表达量均显着降低（P<0.05）,NGF、BDNF、GAP-43蛋白表达量均显着增高（P<0.05）,3组组间比较无显着差异（P>0.05）。结论 1.自制简易脊髓打击器从20mm、40mm高处垂直撞击脊髓组织具有和NYU打击器从12.5mm、25mm处打击脊髓损伤程度相似的脊髓损伤动物模型,自制简易脊髓打击器安全性高,稳定性好,操作简便,价格低廉,可供科研工作者参考。2.通腑逐瘀法治则指导下抵当汤加减可有效消除SCI大鼠损伤处水肿,促进神经功能康复。其具体的作用机制为:通过抑制AQP4的表达可抑制反应性星形胶质细胞活化,减少胶质瘢痕形成,提高神经营养因子、神经生长因子及细胞膜生长相关蛋白的表达,促进神经功能康复。3.DDD含药血清能通过抑制AQP4的表达,有效减轻RAS水肿,减少RAS活化和减缓RAS迁移,促进RAS中神经营养因子的分泌。
张毅[2]（2020）在《基于转录组测序研究川芎嗪对大鼠急性脊髓损伤基因表达的影响》文中研究表明目的:基于转录组测序筛选并探讨川芎嗪干预大鼠急性脊髓损伤（SCI）后脊髓组织的差异表达基因（DEG）,为川芎嗪治疗急性SCI的作用机制提供理论依据。方法:采用6～8周龄SPF级健康雄性SD大鼠30只,体重200～230g,随机分为3组:假手术组（A组/A14d组）6只,模型组（B组,包括B7d组6只、B14d组6只）12只,川芎嗪干预组（C组,包括C7d组6只、C14d组6只）12只;A组造模时仅予暴露出脊髓组织后缝合,B组、C组建立大鼠急性SCI模型,造模成功后C组腹腔注射川芎嗪（100 mg/kg,10 mg/m L,以生理盐水配制）,A组、B组予腹腔注射生理盐水;各组均于造模前、造模后7天（d）、14d时行BBB评分;B7d组、C7d组于造模成功后7天时取材和制作标本,A组、B14d组、C14d组于造模成功后14天时采集和制作标本;对各组随机3只标本进行HE和尼氏染色后行病理形态学观察,3只标本进行转录组测序,筛选和比较基因差异性表达,并对其基因本体（GO）及京都基因与基因组数据库（KEGG）信号通路富集分析。结果:1.BBB评分提示:假手术组未见脊髓损伤;川芎嗪干预组与模型组比较,BBB评分显着升高（P<0.05）。2.HE染色及尼氏染色结果显示:与A组相比,B组、C组均可见脊髓组织损伤;造模后7d、14d时,C组脊髓损伤恢复程度较B组好,脊髓神经元、尼氏体数量显着明显比B组多。3.高通量转录组测序显示:B7d-vs-C7d的DEG 70个,其中上调表达的DEG 42个,下调表达的DEG 28个;B14d-vs-C14d有66个DEG,31个上调表达的DEG,35个下调表达的DEG;A-vs-B7d的DEG 886个,上调表达702个,下调表达184个;A-vs-B14d有1404个DEG,921个上调表达,483个下调表达。4.GO富集分析结果显示:各组对比绝大多数富集到生物学过程（BP）;B7d-vs-C7d富集在BP 300条、细胞组分（CC）34条和分子功能（MF）86条,主要涉及炎症反应、免疫应答、神经元离子通道聚集、止血、疼痛、突触重建、轴突感觉、髓鞘形成等方面;B14d-vs-C14d富集在BP 413条、CC 13条和MF 59条主要涉及免疫调节、儿茶酚胺代谢、细胞因子-细胞因子受体相互作用、神经活性配体-受体相互作用、GABA能突触、多巴胺能突触、氧化应激损伤等方面;A-vs-B7d富集在BP 1796条、CC102条和MF 286条;A-vs-B14d富集在BP 2151条、CC 174条和MF 274条。5.KEGG富集分析结果显示:B7d-vs-C7d有5条通路显着富集,为细胞粘附分子、补体和凝血级联、Hedgehog信号通路等;B14d-vs-C14d有13条通路显着富集,为细胞因子-细胞因子受体相互作用、逆行内源性大麻素信号、神经活性配体-受体相互作用、PPAR信号通路、GABA能突触、Fox O信号通路、多巴胺能突触等;A-vs-B7d有86条通路显着富集,A-vs-B14d有95条通路显着富集。结论:川芎嗪可通过调节炎症反应、免疫应答、神经元离子通道聚集、氧化应激损伤、止血、突触重建、神经性疼痛、GABA能突触、Hedgehog通路、PPAR通路、TGF-β通路、ERBB2-ERBB3通路、Wnt通路、BMP通路等过程从而对SCI细胞凋亡、神经损伤等起保护作用。
巫荣华[3]（2020）在《脊髓损伤后环状RNA和长链非编码RNA的表达谱及在星形胶质细胞中的功能初探》文中研究指明目的:脊髓损伤是一种致残率极高的中枢神经系统疾病,系统而全面地了解脊髓损伤过程中病理生理事件,以及相关的细胞机制和分子机制,对于制定新的治疗策略至关重要。因此,我们建立了大鼠T9半横断模型,对大鼠脊髓损伤后环状RNA、长链非编码RNA、信使RNA等进行较高密度时间点的测序分析,筛选出随时序性变化起重要调控作用的环状RNA和长链非编码RNA。然后在星形胶质细胞中进行功能初探,进一步揭示其分子机制。本课题的开展和完成将有助于从新的角度阐明脊髓损伤修复的机制,为临床治疗提供新的分子干预靶点。方法:1、制备大鼠T9半横断模型。为了全面、准确地研究脊髓损伤过程中环状RNA和长链非编码RNA的时序表达,我们选取了T9半横断后0 h、0.5 h、3 h、6 h、12 h、1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d共11个时间点进行取材,存于液氮后送至公司进行全转录组测序（包括信使RNA,环状RNA和长链非编码RNA测序）。2、环状RNA和长链非编码RNA的鉴定。对于测序后的数据进行筛选,采用实时定量PCR对选取的环状RNA和长链非编码RNA进行表达模式的验证。选取了circRNA＿01477和LncRNA LOC100909675进行进一步的功能探究。3、体外培养脊髓来源的原代星形胶质细胞。采用FISH实验检测circRNA＿01477和LncRNA LOC100909675的细胞定位。设计circRNA＿01477和LncRNA LOC100909675的si RNA和对照si RNA,电转染培养至P2代的星形胶质细胞。采用CCK-8法和Ed U法检测干扰circRNA＿01477和LncRNA LOC100909675对星形胶质细胞增殖的影响;采用划痕实验和Transwell小室实验检测干扰circRNA＿01477和LncRNA LOC100909675对星形胶质细胞迁移的影响;通过流式细胞仪检测干扰circRNA＿01477和LncRNALOC100909675对星形胶质细胞凋亡的影响。4、干扰circRNA＿01477和LncRNA LOC100909675后表达谱分析及验证。将circRNA＿01477和LncRNA LOC100909675敲降后的星形胶质细胞提取RNA后,进行信使RNA芯片分析或测序分析。通过生物信息学分析工具进行聚类分析及蛋白互作网络分析;选取与星形胶质细胞增殖、迁移相关的基因进行实时定量PCR验证。5、体内干扰circRNA＿01477和LncRNA LOC100909675对胶质瘢痕的影响。合成si RNA或者构建AAV病毒进行脊髓损伤后T9位置原位注射。采用实时定量PCR检测干扰效率,通过免疫组织化学方法检测GFAP、NF200等的表达;采用BBB评分和TSE精细评估系统检测大鼠后肢运动功能。结果1:1、免疫组织化学结果显示成功建立了大鼠T9半横断模型。全转录组测序结果显示,在脊髓损伤后的任何时间点（第0、1、3、7、14、21或28天）,360个环状RNA均有差异表达（P<0.05）。在这些环状RNA中,有31个是外显子类型的（占8.61%）,33个是基因间的（占9.16%）,1个是内含子的（占0.28%）,295个是意义重叠的（占81.95%）。94%差异表达的环状RNA水平从第3天开始下降。2、在差异表达的外显子类型中选取了19个环状RNA进行进一步的研究。RNase R处理和经DNA测序鉴定,结果显示环状RNA特征。选取了circRNA＿01477、circRNA＿03612、circRNA＿26782、circRNA＿17645进行q RT-PCR检测。结果显示,所选环状RNA的表达水平在脊髓损伤后显着降低,其模式与RNA-seq结果一致。3、细胞核和细胞质分离实验显示,93.5%的circRNA＿01477分子在胞质中,6.5%的存在于细胞核中。FISH实验结果显示18s r RNA在胞质中表达,而circRNA＿01477在胞质和胞核中都表达。4、采用CCK-8法检测细胞活力,结果显示干扰circRNA＿01477的表达明显降低了星形胶质细胞的活力;Ed U染色结果显示干扰circRNA＿01477的表达明显抑制了星形胶质细胞的增殖。采用Transwell实验和划痕实验来验证敲降circRNA＿01477对星形胶质细胞迁移的影响,结果显示干扰circRNA＿01477的表达显着的抑制了细胞迁移。流式结果显示,敲降circRNA＿01477不会引起星形胶质细胞的凋亡。5、免疫组织化学结果显示,体内降低circRNA＿01477的表达可以减少脊髓中GFAP的表达,减少胶质瘢痕空洞的大小。6、circRNA＿01477 si RNA处理星形胶质细胞后进行表达谱芯片分析,得到差异变化的基因有1528个,其中上调的基因有633个,下调的基因有895个。对差异基因进行GO分析,结果表明,Biological Process板块中富集最多的是趋化性;Cellular Component板块富集最多的是胞外空间;Molecular Function板块富集最多的是细胞因子的活性;基于KEGG通路的顶部富集是细胞因子-细胞因子受体相互作用。7、敲降circRNA＿01477显着降低了IL6R、Ccnd3、Cxcl12、Cxcl14、Gcnt1、Inhbb1、Ntrk2基因的表达水平;抑制circRNA＿01477显着提高了mi RNA-423-5p水平,而mi R-760没有明显变化。在星形胶质细胞中过表达mi RNA-423-5p mimic,q RT-PCR检测Cxcl12、Cxcl14、Gcnt1和Ntrk2的表达,结果显示过表达mi RNA-423-5p,可以明显降低Cxcl12、Cxcl14的表达,而对Gcnt1和Ntrk2的表达没有影响。结果2:1、全转录组测序筛选到1182个差异表达的长链非编码RNA。q RT-PCR验证显示LncRNA LOC100909675在脊髓损伤后各时间点表达逐渐上调,与RNA-seq结果相似。软件分析结果表明LOC100909675不能编码蛋白质,是一个非编码RNA。2、RACE结果显示LOC100909675的全长为1270 bp。细胞核和细胞质分离实验显示,11.2%的LOC100909675分子在胞质中,88.8%的存在于细胞核中。FISH实验结果显示18s r RNA在胞质中表达,而LOC100909675主要在细胞核中表达。3、采用CCK-8法检测细胞活力,结果显示干扰LOC100909675的表达明显降低了星形胶质细胞的活力;Ed U染色结果显示干扰LOC100909675的表达明显抑制了星形胶质细胞的增殖。Transwell实验和划痕实验显示干扰LOC100909675的表达显着抑制了星形胶质细胞的迁移。流式结果显示,敲降LOC100909675不会引起星形胶质细胞的凋亡。4、免疫组织化学结果显示,体内降低LOC100109675的表达可以增加脊髓中NF200的表达,减少胶质瘢痕空洞的大小。5、BBB评分显示,注射AAV9-sh LOC100909675大鼠的后肢运动能力相对于对照组在7 d、10 d和14 d有明显的提高。进一步采用TSE精细运动评估系统评价大鼠的精细运动,结果显示,对照组大鼠髋关节的角度变化率为9.7%,注射AAV9-sh LOC100909675的为16.7%;对照组大鼠膝关节的角度变化率为13.1%,注射AAV9-sh LOC100909675的为18.9%;对照组大鼠踝关节的角度变化率为14.6%,注射AAV9-sh LOC100909675的为30.9%。6、LOC100909675 si RNA处理星形胶质细胞后进行表达谱测序分析,得到差异表达的基因1457个,其中上调表达的705个,下调表达的752个。对差异表达的基因进行GO富集分析,发现富集程度最高的是细胞周期。KEGG富集分析结果显示富集最显着的也是细胞周期。q RT-PCR验证显示,敲降LOC100909675显着降低了与细胞周期相关的基因Anxa1、Anrkb、Brca1、Bub1、Prc1、Kif11、Foxm1、Ect2、Ccna2、Skp2、Cdk1、Cdc20表达,其趋势与测序结果相似。结论:1、成功建立SD大鼠T9半横断模型,筛选到360个差异表达的circRNA和1182个差异表达的LncRNA,提示非编码RNA参与了脊髓损伤的病理生理过程。2、对其中选择的circRNA＿01477的功能和机制的研究表明:该分子主要定位在细胞质中,敲降其表达显着抑制了星形胶质细胞的增殖、迁移和愈伤能力,对凋亡没有影响;体内降低circRNA＿01477的表达可以减少胶质瘢痕空洞的大小。通过GO分析和KEGG分析,circRNA＿01477可能是SCI诱导的免疫炎症反应的重要调控因子,推测其可能通过mi RNA-423-5p-Cxcl12/Cxcl14轴来调控细胞增殖和迁移。3、对其中选择的LncRNA LOC100909675的功能和机制的研究表明:该分子主要定位在细胞核中,敲降其表达显着抑制了星形胶质细胞的增殖、迁移和愈伤能力,对凋亡没有影响;体内降低LOC100909675的表达可以促进SD大鼠后肢功能恢复。根据GO富集分析和KEGG富集分析结果,LOC100909675可能是一个细胞周期调控分子。
林小龙[4]（2020）在《2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉在急性脊髓损伤大鼠模型中的神经保护作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理第一部分2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉在脊髓损伤大鼠模型中的作用目的:既往研究表明2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉（2-（-2-benzofuranyl）-2-imidazoline,2-BFI）在多种病理生理过程中参与抗氧化、抗炎症、抗凋亡。但是2-BFI在脊髓损伤模型中的作用尚不清楚。因此本实验采用钳夹法建立脊髓损伤（spinalcord injury,SCI）大鼠模型并利用该模型探讨2-BFI在脊髓损伤大鼠模型中潜在作用。方法:实验用成年雄性SD大鼠随机分为3组:（1）假手术组（Sham组）;（2）对照组（SCI+vehicle组）;（3）实验组（SCI+2-BFI组）。参照既往文献,建立了脊髓损伤大鼠实验模型。将大鼠麻醉后俯卧位固定置于专用手术台上。取后正中切口,从T10椎板到T12椎板行椎板切除术,充分暴露脊髓。假手术组仅仅行T10-T12椎板切除术,暴露脊髓而不引起脊髓损伤为标准。对照组及实验组大鼠利用70g闭合力Yasargil动脉瘤夹钳夹脊髓60秒,损伤成功的指标包括局部脊髓出现红肿、压迫后双后肢立即抽动、大鼠清醒时双侧后肢麻痹。药物注射（2-BFI腹腔注射3 mg/kg或0.9%生理盐水,每日2次,共3日）由一名对实验分组不熟悉的研究人员进行。所有大鼠在造模后第1、2、3、7、14、21天进行神经功能评估。神经功能评估采用BBB（Basso、Beattie and Bresnahan）神经功能评分量表,评分范围从0分到21分。结果:SCI大鼠运动神经功能采用BBB运动能力评定量表进行评定。假手术组术后即刻、术后1-3天、7天、14天、21天得分均为21分。在SCI发生后第1天,对照组和实验组的BBB运动能力评分均迅速下降,分别为0.17±0.41及0.17±0.41,相对于假手术组,两组的BBB评分呈显着性下降（p<0.05）,但两组之间并无统计学差异（P>0.05）。虽然在SCI发生后第3天,实验组的BBB评分高于对照组,分别为2.00±1.09及1.33±0.82,但两组之间仍无统计学差异（P>0.05）。但在SCI发生后第7天,实验组的BBB评分则高于对照组,且两者差异存在统计学意义（分别为4.33±0.52及3.33±0.52,p<0.05）。同样的结果也出现在SCI发生后第14天,实验组的BBB评分明显高于对照组（6.17±0.98及4.67±0.822,p<0.05）。将观察期延迟到SCI发生后的第21天,实验组的BBB评分明显大于对照组,且两组之间的差距更加明显（8.00±1.10及 6.17±0.98,p<0.01）。结论:通过2-BFI处理后SCI大鼠的BBB评分明显高于对照组,说明腹腔注射2-BFI（3mg/kg）后可显着改善SCI后BBB神经功能评分,在脊髓损伤大鼠模型中具有神经保护作用。第二部分 2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉在脊髓损伤大鼠模型中的神经保护作用机制目的:本部分实验采用钳夹法建立脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）大鼠模型并利用该模型证实 2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉（2-（-2-benzofuranyl）-2-imidazoline,2-BFI）对脊髓损伤大鼠的神经保护作用,并探讨2-BFI神经保护作用机制。方法:根据第一部分实验结论的进一步延续,采用动脉瘤夹钳夹脊髓的方法造模。实验用成年雄性SD大鼠随机分为3组:（1）假手术组（Sham组）;（2）对照组（SCI+vehicle组）;（3）实验组（SCI+2-BFI组）。SCI+vehicle组大鼠腹腔注射0.9%生理盐水,每日2次,共3日;SCI+2-BFI组大鼠腹腔注射2-BFI溶液,剂量为3 mg/kg,每日2次,共3日。药物注射由一名对实验分组不熟悉的研究人员进行。假手术组仅仅行T10-T12椎板切除术,暴露脊髓而不引起脊髓损伤为标准。在脊髓损伤后第3天,所有大鼠均行腹腔注射戊巴比妥钠（100mg/kg）深度麻醉并处死。损伤部位周围脊髓组织立即取出并置于冰面上用200m14℃0.9%生理盐水灌洗。Western blot检测Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白。使用ELISA试剂盒,对脊髓组织样本中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性进行检测。FJB染色和TUNEL染色检测损伤部位周围脊髓组织的细胞坏死和凋亡。结果:与假手术组相比,对照组SOD和GPx活性均明显降低（P<0.01）。同时,SOD和GPx活性在使用2-BFI后明显升高（P<0.05）。脊髓损伤大鼠脊髓组织中Bax蛋白及cleaved caspase-3蛋白水平（p 19和p 17）明显升高,Bcl-2蛋白水平明显降低（P<0.01和P<0.05）。而2-BFI的应用显着提高了 SCI后Bcl-2蛋白水平（P<0.01）,Bax蛋白和cleaved caspase-3蛋白水平（p19和p17）都被下调。与此同时,对照组与假手术组相比,Bcl-2/Bax比值在SCI后明显降低,而在使用2-BFI后,实验组较对照组Bcl-2/Bax比值明显升高（P<0.01）。假手术组脊髓切片未见FJB阳性或TUNEL阳性细胞,然而在对照组中可见大量FJB阳性细胞和TUNEL阳性细胞,使用2-BFI治疗后FJB阳性细胞和TUNEL 阳性细胞数量显着降低（P<0.05和P<0.01）。结论:2-BFI的应用上调SOD和GPx的活性,上调Bcl-2蛋白的表达,下调Bax蛋白和cleaved caspase3（p17和p19）蛋白的表达,进一步证实其神经保护作用。此外,FJB染色和TUNEL染色显示细胞坏死和凋亡水平降低也佐证了 2-BFI的神经保护作用。综上所述,这些结果提示2-BFI可能通过抑制氧化应激反应和细胞凋亡坏死来减轻脊髓损伤,从而提高脊髓损伤后的功能恢复。第三部分 2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉在脊髓损伤大鼠模型中神经保护作用的调节机制目的:本部分实验采用钳夹法建立脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）大鼠模型并利用该模型证实 2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉（2-（-2-benzofuranyl）-2-imidazoline,2-BFI）是否通过激活核转录因子-E2相关因子/血红素加氧酶（Nrf2/HO-1）信号通路,引起下游抗氧化、抗凋亡相应蛋白变化从而保护神经细胞。方法:根据第二部分实验结果的进一步延续,采用动脉瘤夹钳夹脊髓的方法造模。实验用成年雄性SD大鼠随机分为3组:（1）假手术组（Sham组）;（2）对照组（SCI+vehicle组）;（3）实验组（SCI+2-BFI组）。对照组大鼠腹腔注射0.9%生理盐水,每日2次,共3日;实验组大鼠腹腔注射2-BFI溶液,剂量为3mg/kg,每日2次,共3日。药物注射由一名对实验分组不熟悉的研究人员进行。假手术组仅仅行T10-T12椎板切除术,暴露脊髓而不引起脊髓损伤为标准。在脊髓损伤后第3天,所有大鼠均行腹腔注射戊巴比妥钠（100mg/kg）深度麻醉并处死。损伤部位周围脊髓组织立即取出并置于冰面上用200ml4℃0.9%生理盐水灌洗。Westernblot检测Nrf2、HO-1和NQO1蛋白。利用免疫荧光染色技术定位Nrf2蛋白,观察损伤部位周围脊髓组织神经元细胞和星形胶质细胞中的Nrf2表达量变化。结果:与假手术组相比,对照组和实验组脊髓组织中无论Nrf2蛋白还是HO-1蛋白都有明显升高（P<0.01）,而与假手术组相比,对照组NQO1蛋白表达降低（P<0.01）。此外,与对照组相比,实验组Nrf2和HO-1进一步显着升高（P<0.01）。但对照组与实验组NQO1表达差异无统计学意义（P>0.05）。免疫荧光染色显示,Nrf2蛋白无论在神经元细胞还是星形胶质细胞中的表达,对照组及实验组均显着高于假手术组（P<0.01）。此外,实验组神经元细胞内、星形胶质细胞内Nrf2水平明显高于对照组（P<0.01）。结论:脊髓损伤后2-BFI处理增加了 Nrf2蛋白和HO-1蛋白的表达,表明2-BFI可激活Nrf2/HO-1信号保护脊髓损伤后的神经细胞。总之,这些结果为2-BFI通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻脊髓损伤,提高脊髓损伤后的功能恢复提供了有力证据。
李亚锋[5]（2020）在《补阳还五汤对急性脊髓损伤大鼠NLRP1/Caspase-1细胞焦亡通路的影响》文中研究表明脊髓损伤是严重的中枢神经系统疾病,随着社会经济的发展,其发病率逐渐升高,脊髓损伤具有高致残率及高死亡率的特点,脊髓损伤后病理过程复杂,本论文主要探究补阳还五汤对脊髓损伤后NOD样受体蛋白1（NOD-like receptor protein 1,NLRP1）/半胱氨酸蛋白水解酶-1（Cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1）细胞焦亡通路的影响,包括文献综述及实验研究两个部分。第一部分:文献综述此部分包括两篇文献综述。第一篇文献综述介绍了 NLRP1炎性小体在创伤性中枢神经损伤中的作用,主要从NLRP1炎性小体的结构、创伤性中枢神经损伤诱导NLRP1炎性小体的表达、创伤性中枢神经损伤中NLRP1炎性小体的激活和调节以及创伤性中枢神经损伤后针对NLRP1炎性小体的治疗4个方面进行综述;第二篇阐述了补阳还五汤在脊髓损伤中的研究进展,通过脊髓损伤的病理机制、补阳还五汤的药理研究及补阳还五汤在脊髓损伤中的作用3个方面进行综述。第二部分:实验研究目的:探究补阳还五汤对急性脊髓损伤大鼠NLRP1/Caspase-1细胞焦亡通路的影响。方法:将32只健康SPF级雄性大鼠随机分成假手术组、甲强龙组、补阳还五汤组和模型组。通过椎板间隙置入球囊压迫上颈髓造模,造模成功后,补阳还五汤组每天将制备的含颗粒剂2g/mL的补阳还五汤水煎液以1.75ml/kg体重灌胃1次,连续14天;甲强龙组在造模成功后的24小时内经尾静脉注射甲强龙,首剂量为30mg/kg,余以每小时5.4mg/kg,每4小时给药1次;假手术组及模型组每天以1.75ml/kg体重的生理盐水灌胃1次,持续14天。干预后的第1天、3天、7天及14天以BBB评分法评价大鼠神经功能恢复情况,干预14天后用Western Blot法检测大鼠损伤脊髓组织中NLRP1、Caspase-1及IL-18蛋白的表达。结果:BBB评分结果:假手术组大鼠各时间点BBB评分无变化;补阳还五汤组及甲强龙组治疗后3天、7天及14天的评分高于模型组,差异有统计学意义（P<0.05）;干预后的7d及14d,各组大鼠评分变化不明显。干预后14d大鼠损伤脊髓组织中NLRP1、Caspase-1及IL-18蛋白的表达结果:补阳还五汤组以及甲强龙组NLRP1、Caspase-1及IL-18蛋白表达均低于假手术组,高于模型组,差异有统计学意义（P<0.05）,补阳还五汤组以及甲强龙组之间NLRP1、Caspase-1及IL-18蛋白表达无明显差异（P>0.05）。结论:补阳还五汤联合脊髓减压治疗急性脊髓损伤效果明显,可有效干预大鼠脊髓损伤,促进大鼠急性脊髓损伤后的神经功能恢复。其作用机制可能是通过抑制NLRP1/Caspase-1细胞焦亡通路以减少细胞焦亡,但补阳还五汤在在NLRP1/Caspase-1细胞焦亡通路中的具体作用机制有待进一步研究。
赵磊[6]（2020）在《Miro1在脊髓损伤中抑制神经元凋亡及其机制研究》文中指出第一部分脊髓损伤动物模型的建立及评价目的:1.建立合适的脊髓损伤（Spinal Cord Injury,SCI）大鼠模型;2.观察并验证神经元在SCI后的形态变化及凋亡情况。研究方法:1.将雄性SD大鼠54只（体重273-282g）,随机分成空白对照组（Blank,3只）、假手术组（Sham,18只）和脊髓损伤组（SCI,33只）。2.SCI大鼠的造模采用动脉瘤钳夹法（目标节段为T10,动脉瘤夹标定力量70 g,钳夹持续时间30s）。假手术组（Sham）大鼠手术显露T10脊髓节段后,旷置4分钟后缝合。Blank大鼠不予手术。3.对T10及周围脊髓组织取材:随机选取Sham组大鼠3只在手术后72h取材;SCI大鼠18只,在造模后6个时间点分别随机抽取3只大鼠取材（12h、24h、48h、72h、7d、14d）;Blank大鼠在体重=278±2g取材。将取材组织制作成冰冻切片。4.神经行为学评分:采用BBB评分;对脊髓损伤组和假手术组大鼠进行评分（SCI组15只;Sham组15只）,记录术前以及术后12h、24h、48h、72h、7d、14d共7个时间点的BBB评分。5.取不同组的大鼠脊髓冰冻切片进行尼氏染色（Nissl染色）,观察神经元的形态及尼氏小体的变化。进行TUNEL染色观察神经元凋亡情况。结果:大鼠在造模后即发生全瘫（BBB Score=0）,72h的BBB评分略微波动（0.43±0.40）,在7d出现明显的上升（8.03±0.53）;Sham组大鼠术后24h内BBB评分较正常略有下降（24h:20.33±0.61）,48h后恢复正常（BBB Score=21）。尼氏染色见脊髓损伤后神经元的尼氏小体逐渐减少,72h最少,之后稍有恢复。TUNEL染色见脊髓损伤大鼠在72h神经元凋亡数量最大。Sham组与Blank组切片,两种染色后的结果均接近。结论:本研究利用的动脉瘤夹钳夹法可成功制备急性脊髓损伤大鼠模型,是一种经济、可靠的建模方法。本组研究发现SCI后72h的神经元凋亡是峰值。第二部分Miro1在大鼠脊髓损伤不同时间段的变化目的:1.观察Miro1在SCI后的变化规律;2.明确Miro1变化与神经元凋亡的关系。研究方法:1.雄性SD大鼠54只（体重276-285g）,随机分成空白对照组（Blank,6只）、假手术组（Sham,9只）和脊髓损伤组（SCI,39只）。SCI造模、Sham组及Blank组处理同第一部分。2.随机选取Sham组大鼠6只、SCI组大鼠36只与6只Blank大鼠分别取材,提取脊髓的RNA及总蛋白。Sham组在空白手术后72h进行;SCI组在6个时间点进行（12h、24h、48h、72h、7d、14d）n=6×6;Blank组大鼠在体重=278±2g时取材。3.采用qRT-PCR定量检测SCI组6个不同时间点及Blank、Sham组大鼠的T10节段Miro1的基因表达情况（n=3）;采用Western-Blot法检测Miro1的表达量（n=3）。4.Sham组及SCI组在术后72h各取三只大鼠制作脊髓冰冻切片（n=3）,采用免疫荧光法对其Miro1表达阳性的神经元和星形胶质细胞观察和计数。结果:qRT-PCR:SCI后T10节段Miro1的基因表达量逐渐增高,在72h达峰,后有所回落,至14d仍高于对照组。Western-Blot:SCI后T10节段Miro1的表达量增高,72h达最大值。免疫荧光染色:神经元及星形胶质细胞中均可见Miro1的阳性表达;SCI-72h组脊髓节段Miro1表达阳性的神经元细胞占总神经元细胞的比率较Sham对照组明显增高（p<0.01）;星形胶质细胞增多,Miro1表达阳性的细胞亦增多（p<0.01）。结论:Miro1在脊髓损伤之后会出现反应性增高;其变化趋势与神经元凋亡趋势吻合,Miro1可能参与调控了大鼠脊髓损伤后神经细胞的凋亡过程。第三部分Miro1在脊髓损伤中对神经元凋亡的抑制及其机制探讨目的:1.抑制SCI后Miro1在脊髓中的表达并验证;2.观察神经元凋亡情况及脊髓功能的改变;3.观察与Miro1可能相作用的线粒体转运分子及凋亡相关分子表达的变化,并探索Miro1对SCI后神经元凋亡的影响机制。研究方法:1.雄性SD大鼠60只（体重273-282g）,随机分为空白对照组（Sham）、生理盐水对照组（NS）、溶剂对照组（MOCK）和实验组（Si RNA）四组。Sham组接受空白手术,同前两部分;其余三组显露T10节段:NS组在T10节段以微量注射泵推注生理盐水8μl;MOCK组推入转染试剂8μl;实验组推入含有Si RNA的转染复合物8μl。上述操作后将NS组、MOCK组及Si RNA组大鼠以动脉瘤夹钳夹造成脊髓损伤。2.每组选取6只大鼠,记录术前、术后12h、24h、48h、72h、7d和14d七个时间点的BBB评分并记录统计。3.实验取材均在手术后72h进行,进行RNA、脊髓总蛋白提取及冰冻切片制作。4.qRT-PCR检测不同组间脊髓节段Miro1的基因表达情况（n=3）;Western-Blot法检测不同组间Miro1的表达情况（n=3）。5.Western-Blot法检测驱动蛋白重链（Kinesin Heavy Chain,KHC）,驱动蛋白轻链1（Kinesin Light Chain 1,KLC-1）,动力蛋白中间链（Dynein Intermediate Chain,DIC）,线粒体锚定蛋白（Syntaphilin,SNPH）,凋亡相关基因蛋白BAX和B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,BCL-2）的表达情况。6.不同组间大鼠脊髓切片TUNEL染色观察凋亡情况（n=3）。结果:1.qRT-PCR及Western-Blot都提示在SCI后72h,Si RNA组Miro1的基因表达或蛋白表达量较MOCK组及NS组均下降。2.Si RNA组较MOCK组及NS组的KHC及SNPH表达明显下降,DIC及KLC-1无显着变化;Si RNA组的BAX表达增加,Bcl-2表达下降,BAX/Bcl-2增大。3.TUNEL染色:Si RNA组阳性细胞较MOCK组及NS组明显增多。4.BBB评分:SCI后Si RNA组的BBB评分（7d:6.5±0.45;14d:8.58±0.80）较MOCK的BBB评分（7d:7.67±0.75;14d:9.67±0.75）在7d和14d均有明显下降（7d:p<0.01;14d:p<0.05）。结论:Miro1通过与驱动蛋白（Kinesin）相结合和线粒体锚定蛋白（Syntaphilin）作用,参与调控的线粒体运动作用于脊髓损伤大鼠神经元的凋亡过程,并且在一定程度上保护神经元。且这一调控过程最可能是通过调节BAX/Bcl-2两种蛋白量的比例这一通路实现的。其中与驱动蛋白作用位点主要考虑为驱动蛋白重链（KHC）。第四部分慢病毒载体注射致Miro1过表达对改善脊髓损伤预后的探讨目的:1.利用慢病毒载体技术使Miro1在脊髓节段中过表达;2.观察并验证SCI后脊髓节段Miro1的表达量改变;3.观察神经元凋亡情况及脊髓功能的改变;4.进一步验证Miro1对SCI后神经元凋亡的影响机制。研究方法:1.依照Miro1基因（RHOT1）设计,对GV492-Miro1慢病毒载体进行构建与生产;2.将空载慢病毒（GV492）和过表达载体慢病毒（GV492-Miro1）调成1×109TU/ml的悬液。SD雄性大鼠6只（体重271-276g）并分成两组,在T10节段分别将8μl空载慢病毒悬液和Miro1过表达载体慢病毒悬液推入大鼠脊髓;术后第7天将两组大鼠处死及取材,制作冰冻切片,DAPI封片,共聚焦显微镜观察计数、统计。证实感染效率。3.60只雄性SD大鼠（体重278-287g）随机分成空白对照组（Sham）、生理盐水对照组（NS组）、空载慢病毒对照组（Lenti-Ctrl）和实验组（Lenti-Miro1）四组。各组大鼠进行两次手术:a.注射手术:NS组、Lenti-Ctrl组和Lenti-Miro1三组大鼠显露T10脊髓节段,分别缓慢将8μl生理盐水、空载慢病毒悬液和过表达载体慢病毒悬液推入脊髓T10。Sham组大鼠作为对照,仅暴露不注射,操作同第一部分实验Sham组大鼠相同。第一次术后大鼠饲养七天进行下一阶段。b.脊髓损伤手术:NS组、Lenti-Ctrl组和Lenti-Miro1三组大鼠再次显露T10脊髓节段并钳夹造模。Sham组大鼠接受二次手术作为对照,显露硬膜囊后暴露创面120s后缝合伤口。4.对四组大鼠均随机选取6只进行BBB评分,在第一次手术前和手术后的12h、24h、48h、72h、7d;第二次手术后的12h、24h、48h、72h、7d、14d观察大鼠的BBB评分。5.每组大鼠均在二次手术结束后72h处死进行取材,提取脊髓RNA或总蛋白。6.qRT-PCR检测不同组间Miro1的基因表达情况（n=3）;Western-Blot检测不同组间Miro1的表达情况（n=3）。7.Western-Blot法测定KHC、KLC-1、DIC、SNPH、BAX和BCL-2的表达情况（n=3）。8.不同组间大鼠脊髓节段TUNEL染色观察凋亡情况（n=3）。结果:1.大鼠T10节段在注射空载慢病毒（GV492）和过表达载体慢病毒（GV492-Miro1）后7d,共聚焦显微镜下可检测到病毒转染阳性神经元细胞,且两组阳性细胞数无显着差异。2.qRT-PCR及Western-Blot均提示在SCI-72h,Lenti-Miro1组Miro1的基因表达或蛋白表达量较Lenti-Ctrl组及NS组均上升;3.Lenti-Miro1组较Lenti-Ctrl组的KHC及SNPH表达亦明显上升,DIC及KLC-1无显着变化;Lenti-Miro1组的BAX表达变化不明显,Bcl-2表达升高,BAX/Bcl-2下降。4.TUNEL染色:Lenti-Miro1组阳性细胞较Lenti-Ctrl组及NS组减少。5.BBB评分:Lenti-Miro1组的BBB评分（SCI术后7d:8±0.45;14d:11.75±1.17）及Lenti-Ctrl组评分（7d:7.67±0.75;14d:9.75±0.52）,7d时两组差异不大（p>0.05）;14d显着增高（p<0.01）。结论:慢病毒载体使得脊髓局部过表达Miro1可改善脊髓损伤神经元的凋亡情况,保护神经元功能。进一步证实了Mrio1在脊髓损伤中通过与Kinesin及Syntaphilin作用,调控线粒体转运,进而抑制神经元的凋亡而对神经元起到保护作用。慢病毒载体局部注射使脊髓过表达Miro1,为生物治疗改善脊髓损伤对脊髓功能的损害提供一定的理论基础。
何剑波[7]（2020）在《补肾活血方通过Notch通路促进血管新生对脊髓损伤的修复作用及机制研究》文中进行了进一步梳理目的:（1）脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）后,在原发损伤的基础上会出现严重的继发性损伤,造成二次伤害,带来严重的并发症。二次损伤的机制十分复杂,既往研究发现脊髓损伤后使损伤局部出现微循环血管网的破坏,目前对于脊髓损伤后血管破坏有一定的研究,但对于血管网破损及其血管新生和修复的机制还不是十分明确。本研究目的之一即观察脊髓损伤后血管网的变化情况,并且基于Notch通路、VEGF、Ang-1/Tie-2等血管新生因子探讨血管新生的相关机制;同时观察损伤后神经细胞的变化情况,为通过促进血管新生治疗SCI提供相关的理论基础。（2）研究Notch-1蛋白和EGFL-8蛋白对HUVEC血管内皮细胞和Schwann神经细胞增殖、划痕和迁移等的影响,探讨它们对血管新生和神经保护的作用。（3）在中医辩证理论指导下,急性脊髓损伤属于肾虚血瘀证,治当补肾活血。本实验拟通过运用补肾活血方（BSHXF）进行相关研究,体外实验中观察BSHXF对血管内皮细胞（HUVEC）成血管的作用;体内实验中观察其对SD大鼠脊髓损伤后损伤组织区域血管网修复的影响和相关机制,及其对SCI后神经细胞的影响。方法:（1）脊髓损伤后微循环血管网的变化及相关机制研究。将正常SD大鼠分为假手术组（Sham组）和模型组（SCI组）,观察SCI后不同时间点BBB行为学评分,HE染色观察损伤区域的病理情况;免疫荧光染色观察相关血管二维情况;microfil血管灌注造影后行micro-CT扫描,观察血管的三维结构情况;Western blot实验检测Notch-1、VEGF、Ang-1/Tie-2和EGFL-8相关蛋白的变化情况;免疫荧光实验观察损伤区域GFAP和MAP-2蛋白的表达情况。（2）运用细胞增殖、划痕、tube formation和Western blot相关实验观察Notch-1蛋白和EGFL-8蛋白对血管内皮细胞（HUVEC）的增殖、划痕愈合、迁移及血管形成功能的影响,以及它们对Schwann细胞的增殖、划痕和在transwell小室中迁移的影响。（3）BSHXF对大鼠脊髓损伤模型的治疗作用、血管新生和相关机制的研究。体外实验观察BSHXF对HUVEC细胞的增殖、划痕、迁移及血管形成的影响,及其对鸡胚血管新生的作用。体内实验中观察BSHXF对SCI大鼠BBB行为学评分的影响,检测BSHXF对损伤局部血管网的修复情况,Western blot和PCR实验检测BSHXF对损伤脊髓中Notch通路、Ang-1/Tie-2和EGFL-8等相关通路的影响;检测BSHXF对SCI动物模型氧化应激反应、星形胶质细胞和神经元细胞的影响。结果:（1）BBB行为学评分提示脊髓损伤造模后会即刻出现双下肢完全瘫痪,在损伤后第1周和第2周会有一定程度的康复,BBB评分恢复程度较多;第3周和第4周进入较为缓慢的康复期,其BBB评分改善程度较小。microfil血管造影和CD31免疫荧光实验结果提示脊髓损伤后出现血管密度下降;尽管在损伤后会有一定的自我修复,但仍然有一定的局限性,到第28天时仍然存在血管网的缺损。WB实验探讨相关机制研究结果提示,在急性脊髓损伤动物模型中,Notch-1首先会出现应激性上调,在损伤第3天时其表达量达到高峰,在第7天时虽然较第3天有所下降,但仍然比正常组要明显上调;到第14天时,其表达量出现下降;到第28天时,会进一步地出现下降,明显低于正常组的表达量。相应地,N otch下游通路Jag-1,Hes-1,以及VEGF和Ang-1/Tie-2的表达量也出现与Notch-1大致类似的先升后降的表达趋势,说明Notch-1调控VEGF和Ang-1/Tie-2等相关血管新生因子参与脊髓损伤后的血管新生。同时,EGFL-8蛋白在脊髓损伤后,在损伤第7天时,出现升高的趋势,达到高峰;在第14天开始逐渐下降,但仍然较正常组的表达量要高;到第28天时持续下降,提示EGFL-8可能具有一定的促血管新生的作用,但其参与血管新生的时间点与Notch不一致。伴随着脊髓损伤后血管网的破坏,损伤区域神经元细胞数量出现减少,星形胶质细胞出现活化,尤其是后期由于过度活化形成的胶质瘢痕可能对血管新生和神经功能修复造成一定的影响。（2）体外实验结果提示,Notch-1蛋白在200ng/ml浓度时能够促进HUVEC细胞的增殖、划痕愈合、迁移以及血管形成的能力,对Schwann细胞的增殖、划痕愈合和迁移有促进作用,其抑制剂DAPT会减弱其效果。EGFL-8与Notch-1蛋白具有类似的效果,在100ng/ml时,可促进血管内皮细胞的增殖、划痕和血管的形成,同时,也能促进Schwann细胞的增殖和迁移,具有潜在的神经保护的作用。（3）在BSHXF的相关实验中,当浓度为7.5mg/ml时,可以促进HUVEC的增殖、细胞划痕愈合、迁移和血管形成,同时对鸡胚血管新生具有一定的促进作用。在动物实验中,SCI大鼠进行BSHXF干预后,与模型组相比,BSHXF治疗组中BBB评分得到明显的改善。microfil血管造影及荧光染色提示BSHXF对局部血管网的修复具有一定的改善作用。Western blot和PCR实验结果表明,经过BSHXF的干预治疗,Notch-1、Ang-1/Tie-2和EGFL-8的蛋白表达量出现升高,提示BSHXF通过Notch-1调控血管新生参与急性脊髓损伤后血管网的修复。伴随着损伤区域血管的修复,脊髓损伤组织中SOD、MDA活力情况得到平衡,Nox-1和H0-1等氧化应激相关蛋白的表达量得到改善;GFAP蛋白的表达量出现降低,星形胶质细胞的活化水平减小,同时,MAP-2的表达量升高,说明神经元细胞得到一定的保护,因而促进了脊髓损伤后神经功能的修复。结论:（1）Notch-1调控VEGF、Ang-1/Tie-2和EGFL-8参与脊髓损伤后血管新生的机制中。（2）Notch-1蛋白和EGFL-8蛋白可促进HUVEC细胞增殖、划痕愈合、迁移和血管形成,具有一定的促血管新生的作用;对Schwann细胞的增殖、划痕愈合和迁移具有促进作用,具有潜在的神经保护作用。（3）体外实验中,补肾活血方具有促进血管新生的作用;体内实验中,补肾活血方可以通过Notch-1调控VEGF、Ang-1/Tie-2和EGFL-8促进脊髓损伤后的血管新生,可改善局部氧化应激反应和抑制星形胶质细胞的过度活化,对神经元细胞具有一定的保护,从而起到改善SCI后神经功能的作用。
李可[8]（2020）在《电针大椎穴、命门穴对脊髓损伤大鼠PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响》文中进行了进一步梳理1研究目的与意义脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）是由创伤或非创伤事件导致脊柱骨折或脱位,患者长期的残疾对个人、家庭、社会都会带来严重的负担。脊髓损伤继原发性损伤后发生的一系列的继发性病理生理变化,包括细胞凋亡、炎症和神经变性,是影响脊髓损伤后神经再生和恢复的主要障碍。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phosphoinosmde-3-kinase/protein kinase B/the mammalian target of rapamycin,PI3K/AKT/mTOR）信号通路是调控细胞凋亡、自噬,参与机体免疫、代谢等重要机体活动的信号通路之一,对脊髓损伤的发展、治疗、预后至关重要。电针大椎穴、命门穴治疗脊髓损伤在临床上取得明确疗效,但相关机制尚未明确。本研究旨在阐明电针大椎穴、命门穴对脊髓损伤后PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响,进一步阐明电针改善脊髓损伤后病理损伤的机制,为临床电针治疗脊髓损伤提供科学依据。2研究方法本研究采用动物实验方法,将SD大鼠随机分为空白组、假手术组各18只,模型组、电针组各54只。模型组、电针组各54只大鼠随机分1天亚组、14天亚组、28天亚组各18只。模型组、电针组大鼠利用改良式Allen’s打击法复制T10脊髓损伤动物模型后。电针组大鼠每日于大椎穴、命门穴进行电针干预20分钟,空白组、假手术组、模型组大鼠不予电针刺激,仅每日相同时间、相同强度进行抓取、固定,以保证相同的处理条件。1天亚组、14天亚组、28天亚组大鼠分别再干预1天、14天、28天后进行取材、检测。采用Basso,Beattie&Bresnahan（BBB）运动功能评定量表对大鼠进行肢体运动功能评分,评价电针大椎穴、命门穴对脊髓损伤模型大鼠运动功能恢复的影响;采用磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging,MRI）、苏木素-伊红染色（Hematoxylin-eosin,HE）染色观察大鼠脊髓组织,评价电针大椎穴、命门穴对脊髓损伤模型大鼠受损脊髓形态组织的影响;采用免疫组化、蛋白免疫印迹（Westernblot,WB）分析检测脊髓损伤模型大鼠受损脊髓组织PI3K/AKT/mTOR信号通路相关指标,包括PI3K、p-PI3K、AKT、mTOR、p-mTOR、p70 核糖体蛋白s6激酶（p70 Ribosomal Protein S6 Kinase,p70S6K）、p-p70S6K、10 号染色体上缺失的磷酸酶与张力蛋 白 同源物基因（phosphatase and tensinhomology deleted on chromosome ten,PTEN）论证电针大椎穴、命门穴对脊髓损伤模型大鼠PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响;WB检测脊髓损伤模型大鼠受损脊髓组织半胱氨酸蛋白酶 3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3,caspase 3）评价电针大椎穴、命门穴对脊髓损伤模型大鼠脊髓受损后细胞凋亡、自噬的影响。3研究成果3.1 BBB运动功能评定量表结果示:干预1天、14天、28天,模型组大鼠BBB运动功能评定量表评分分值均明显低于空白组、假手术组,差异具有统计学意义（P<0.01）,电针组大鼠BBB运动功能评定量表评分分值均明显高于模型组,差异具有统计学意义（P<0.01）,且随着电针干预大椎穴、命门穴干预时间越长,脊髓损伤大鼠肢体功能恢复越明显（P<0.01）。3.2 MRI结果示:空白组、假手术组大鼠脊髓无变形、脊髓信号无异常,模型组、电针组大鼠脊髓损伤、脊髓受损区域有高信号。随着时间的推移（1天、14天、28天）,模型组、电针组大鼠脊髓损伤模型大鼠脊髓炎症区面积逐渐减小（P<0.01）;电针组大鼠脊髓损伤炎症T2WI高强度区面积减小程度明显高于模型组,随着时间的推移（1天、14天、28天）,差异越明显（P<0.01）。3.3 HE染色结果示:空白组、假手术组大鼠脊髓组织、细胞结构完整,灰质呈蝴蝶状,白质排列致密,与灰质间界限清晰。模型组、电针组大鼠脊髓组织明显破坏,随着时间推移,受损脊髓组织有一定的自我恢复。总体来说,模型组大鼠脊髓损伤组织破坏严重,脊髓损伤部位脊髓灰质与白质分界不清、结构混乱,白质松散不规则,且有较多大的坏死空洞存在,血细胞和炎性细胞浸润。电针组和模型组相比,脊髓空洞腔小,且腔处组织较更紧密,细胞排列较整齐,炎性细胞浸润及血细胞明显减少。3.4免疫组化结果示:干预1天、14天、28天,模型组大鼠脊髓组织caspase 3、p-PI3K、p-mTOR的MOD值经统计学分析,均高于空白组、假手术组,差异具有统计学意义（P<0.01）;电针组大鼠脊髓组织caspase 3的MOD值低于模型组、高于空白组、假手术组,p-PI3K和p-mTOR的MOD值高于模型组,经统计学分析,有显着性差异（P<0.01）。3.5 WB结果示:空白组、假手术组、模型组、电针组大鼠脊髓组织p-mTOR的表达明显高于腹腔注射mTOR阻滞剂雷帕霉素后,经统计学分析具有显着性差异（P<0.01）,而电针组大鼠脊髓组织p-mTOR的表达明显高于模型组,差异具有统计学意义（P<0.01）;干预1天、14天、28天,与空白组、假手术组相比,脊髓损伤模型大鼠脊髓损伤组织中 p-PI3K/PI3K、p-mTOR/mTOR、p-p70S6/p70S6、AKT 水平明显降低,caspase3、PTEN的表达水平升高（P<0.01）,而电针组大鼠脊髓损伤组织中p-PI3K/PI3K、p-mTOR/mTOR、p-p70S6/p70S6、AKT 水平均明显高于模型组,caspase 3、PTEN 则低于模型组（P<0.01）。并且各指标与一天亚组相比,变化差值均有统计学意义（P<0.01）。4结论4.1电针大椎穴、命门穴能有效改善脊髓损伤模型大鼠下肢的运动功能恢复。4.2电针大椎穴、命门穴能对脊髓损伤模型大鼠受损脊髓部位的组织起到修复作用,且干预时间越长。4.3电针大椎穴、命门穴可能通过PI3K/AKT/mTOR信号通路干预脊髓损伤模型大鼠受损脊髓组织细胞凋亡、自噬。
杨军[9]（2020）在《放射性脑和视神经损伤的功能磁共振研究》文中指出[目的]急性放射性损伤危害严重,当发生急性放射性损伤时需要及时准确的进行评估。目前,尚无有效的成像方法进行评估早期急性放射性脑损伤的严重程度。本研究探讨多模态MRI评估急性放射性脑损伤的严重程度。[方法]根据不同的辐射剂量产生不同程度的放射性脑损伤,成年SD雄性大鼠分为五组,接受单次辐射剂量的全脑照射,照射剂量分别为0（对照组）、10、20、30、40 Gy。DCE-MRI、IVIM-MRI和MRS在放射性损伤后第5天进行,测量DCE-MRI的参数Ktrans、Ve、Vp 和 iAUC,IVIM-MRI 的参数 S0、f 和 D*以及 MRS 的参数 NAA/Cho、NAA/Cr 和Cho/Cr。定量参数与辐射剂量等级之间的相关性采用Spearman等级相关系数进行分析。采用受试者工作特征曲线（ROC）下面积用于检验每个定量参数判断放射性脑损伤程度的诊断价值。免疫组织化学、Western blot和透射电镜用于确定放射性损伤后神经元和神经胶质细胞的组织病理学变化以及超微结构的改变。[结果]对于DCE,随着辐射剂量的增加,Ktrans、Ve、Vp和iAUC显着增加。对于IVIM,随着辐射剂量的增加,S0、f和D*也显着增加。DCE的Ktrans、Ve和iAUC以及IVIM的S0、f和D*,30 Gy组的值显着高于其他组（P<0.05）。对于DCE中的Ktrans、Ve和iAUC以及IVIM中的S0、f和D*与辐射剂量等级呈显着正相关,尤其是Ktrans、iAUC和S0在辐射剂量等级之间具有非常好的相关性（r>0.5,P<0.05）。MRS显示30 Gy组NAA/Cr比值明显低于其他各组（P<0.05）,NAA/Cho 比值明显下降（P<0.05）;20 Gy和30 Gy组的Cho/Cr值高于0 Gy和10 Gy组（P<0.05）。Western blot显示随着照射剂量从10 Gy增加至30 Gy,大脑皮质中VEGF蛋白表达也增加,20 Gy和30 Gy组较为明显（P<0.05）,caspase-3蛋白表达上调,30 Gy组较为明显（P<0.05）。免疫组化GFAP染色显示20 Gy组和30 Gy组星形胶质细胞数量明显增加（P<0.05）。MBP染色显示对照组与各个实验组间的差异无统计学意义（P>0.05）。电镜结果显示10Gy组中观察到轻度髓鞘空泡化,20 Gy组中观察到髓鞘空泡化加重及细胞质水肿,30 Gy组中神经元形态明显异常,出现核浓缩和线粒体萎缩。ROC结果显示DCE、IVIM和MRS定量参数对于诊断30 Gy组效能高于10 Gy和20 Gy组。[结论]多模态MRI可以在早期阶段评估急性放射性脑损伤,特别是高剂量辐射暴露下准确性较高。[目的]在颅脑肿瘤放射治疗中会不可避免的造成正常组织的放射性损伤,当海马受到损伤后会导致患者的神经认知功能下降,严重影响患者的生活质量,对于幼儿较为严重。本研究以幼年大鼠放射性脑损伤为模型,探讨放射性损伤急性期和早期延迟期海马中炎症小体、细胞焦亡和细胞凋亡的变化特点,并用锰离子增强磁共振成像（Manganese-enhanced MRI,MEMRI）检测这些变化过程。[材料和方法]60只4周龄雄性SD大鼠分为对照组（0 Gy）和2个实验组（15 Gy和25 Gy）。实验组接受单次剂量15 Gy和25 Gy的全脑照射,分别于照射后4天和8周进行MEMRI和MRS检查。测量海马的锰离子增强信号强度（Signal intensity,SI）和代谢物的变化情况。MRI检查结束后取海马组织用Western blot检测海马组织中炎症小体AIM2、GSDMD、NLRP1 和 NLRP3 和细胞凋亡蛋白 cleaved caspase-1、cleaved caspase-3 的变化情况。采用ELISA法检测海马中炎性因子IL-1β和IL-18的表达情况。透射电镜用于观察细胞凋亡的情况。[结果]15 Gy组和25 Gy组海马中炎症小体AIM2、GSDMD、NLRP1和NLRP3在辐射后4天和8周与对照组相比均无明显变化（P>0.05）。与对照组相比炎性细胞因子IL-1β和IL-18在第4天和第8周的变化无显着性差异（P>0.05）。照射后4天,照射组凋亡蛋白 cleaved caspase-1、cleaved caspase-3 活性明显增强,尤其是 cleaved caspase-3（P<0.05）。而 cleaved caspase-1、cleaved caspase-3 在照射后 8 周表达减少,但 cleaved caspase-3仍明显高于对照组（P<0.05）。MEMRI显示各组中左侧海马和右侧海马的SI无显着性差异（P均>0.05）。照射后4天,海马的SI明显降低,25 Gy组尤为明显（P<0.05）;照射后8周,15 Gy组和25 Gy组SI均有不同程度的升高,但25 Gy组SI仍明显低于对照组（P<0.05）。MRS显示照射后第4天,15 Gy组和25 Gy组的代谢物NAA/Cr均显着降低（P<0.05）;15 Gy组8周时NAA/Cr升高（P>0.05）,25 Gy组仍明显低于对照组（P<0.05）。电镜结果显示照射后4天和8周,25 Gy组中凋亡的神经细胞数量均多于15 Gy组,照射后4天的细胞凋亡比照射后8周明显,两个时间点均未观察到焦亡小体。[结论]在放射性脑损伤的急性期和早期延迟期,起主要作用的是细胞凋亡,而非炎症小体或细胞焦亡。MEMRI可检测放射性脑损伤后细胞凋亡的变化情况。1H MRS是MEMRI的重要补充,两者结合能更好评价放射损伤后神经病理生理的变化。[目的]放射性视神经病变是眼眶周围肿瘤放射治疗后的一种严重并发症,但对其发病机制和影像学表现的认识尚不清楚。在本研究中,利用MEMRI来评估树鼩和大鼠放射性视神经损伤的轴突运输功能变化情况。[方法]研究1:利用MEMRI比较树鼩与大鼠的视觉系统。在MEMRI上测量正常成年树鼩和大鼠的眼球、晶状体、视网膜厚度、视神经宽度、玻璃体腔体积和视上丘面积。研究2:连续MEMRI监测放射性视神经损伤后的轴突运输功能。树鼩和大鼠视神经接受20 Gy（每次10 Gy,间隔5天）,照射后5、10、20至30周连续进行MEMRI监测,测量视神经和上丘的对比噪声比（Contrast-to-noise ratio,CNR）。研究3:1H MRS测量放射性损伤后视交叉附近丘脑中代谢物的变化。1H MRS的检测时间点与MEMRI的时间点一致。每次MRI扫描前24小时,将2 μ l 30 mmol/L氯化锰（MnCl2·4H2O）溶液缓慢注射入动物的一侧眼球玻璃体腔内。在观察终点对进行视觉诱发电位（Visual evoked potential,VEP）检测大鼠视觉功能,检测后视神经取材进行Western blot检测轴突运输动力相关的马达蛋白（Kinesin-1、Kinesin-2、Cytoplasm dynein和Tau）,免疫荧光法观察轴突细胞骨架蛋白（α-tubulin、β-tubulin、SMI-31、MBP和MAP-2）,利用荧光金逆行标记视网膜神经节细胞（Retinal ganglion cells,RGCs）并计数。透射电子显微镜观察树鼩和大鼠视神经的超微结构。[结果]MEMRI显示树鼩的眼球、晶状体、玻璃体体积、视神经和上丘明显大于大鼠（P<0.05）,而视网膜厚度则无显着性差异（P>0.05）。放射性视神经损伤后,树鼩组视神经和上丘的CNR在5-30周内逐渐下降。放射损伤后20-30周,实验组CNR明显低于对照组（P<0.05）。大鼠视神经和上丘的CNR与树鼩相似。照射组后5周至30周视神经和上丘的CNR变化,树鼩组分别降低44.29%和65.29%,大鼠组分别降低48.07%和71.53%。1H MRS显示照射后10周至20周和30周,NAA/Cr代谢率逐渐降低,尤其是30周下降较为明显（树鼩组P<0.05,大鼠组P<0.05）。VEP结果显示照射组与对照组的N1值无显着性差异（P>0.05）。照射组N1-P1波幅值降低,与对照组相比有显着性差异（P<0.05）。Western Blot结果显示,与对照组相比,照射组的Cytoplasm dynein、Kinesin-1和Kinesin-2蛋白水平显着降低（P均<0.05）。照射组Tau蛋白略有升高,与对照组比较无显着性差异（P>0.05）。免疫荧光结果显示,实验组和对照组的 α-tubulin、β-tubulin、SMI-31、MBP 和 MAP-2 差异无显着性（P均>0.05）。照射组与对照组大鼠的RGCs计数无显着性差异（t=0.053,P=0.958）。电镜结果显示照射组轴突密度降低,轴突异常扩张、肿胀,出现大量空泡、脱髓鞘和髓鞘分离。[结论]树鼩在MEMRI视觉神经科学研究中显示出明显的优势。RION轴突运输下降的主要原因是马达蛋白不足,而轴突的细胞骨架结构受损也起到一定作用。MEMRI可以检测放射性损伤后早期至晚期轴突运输功能的变化,同时观察视神经轴突结构的相对完整性。
张富荣[10]（2020）在《依达拉奉联合甲强龙对大鼠急性脊髓损伤后神经组织的保护作用研究》文中研究表明目的:急性脊髓损伤是创伤性神经系统疾病之一,能够造成损伤平面以下神经功能的减弱或丧失。急性脊髓损伤病理发展过程包括原发性损伤和继发性损伤。既往的研究结果显示:急性脊髓损伤后,有效地控制损伤组织水肿、炎症性反应等继发性损伤可以减少神经细胞发生凋亡,有利于减轻损伤平面以下感觉及运动的受损程度,进而促进神经功能的恢复。依达拉奉是一种自由基清除剂,能够减缓和控制继发性脊髓损伤的发生,对急性脊髓损伤期神经细胞具有保护性作用。甲强龙是目前治疗急性脊髓损伤的首选药物,但是因其临床治疗需要较大剂量,存在导致消化系统和内分泌系统紊乱等不良反应的风险。本研究旨在研究减少甲强龙使用剂量的条件下,探讨依达拉奉与甲强龙联合应用对于大鼠急性脊髓损伤神经组织的保护作用。研究方法:选取165只成年SD大鼠,随机分为5组（每组33只）:假手术组、急性脊髓损伤组、依达拉奉治疗组（0.3mg/100g）、甲强龙治疗组（3mg/100g）和联合治疗组（依达拉奉0.3mg/100g+甲强龙1.5mg/100g）。采用改良Allen法制作大鼠T10节段急性脊髓损伤模型。应用后肢运动学评分标准（BBB评分）分别于术后1、2、7和14d对各组大鼠进行评分;术后1、2、7d应用干湿重法测定各组脊髓损伤组织的含水量,采用TUNEL法检测各组脊髓损伤组织中神经细胞凋亡率的变化,Western blot法检测各组脊髓损伤组织中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达水平变化。结果:1.与急性脊髓损伤组相比,药物治疗各组大鼠的BBB评分显着增高（P<0.05）;脊髓损伤组织的含水量显着降低（P<0.05）,神经细胞凋亡率以及Bax、Caspase-3的蛋白表达水平均显着降低（P<0.05）,而Bcl-2的蛋白表达水平显着增高（P<0.05）。2.与依达拉奉或甲强龙治疗组相比,联合治疗组大鼠的BBB评分显着增高（P<0.05）;脊髓损伤组织的含水量在术后1d时无显着差异（P﹥0.05）,术后2d时显着降低（P<0.05）,术后7d时联合用药组脊髓损伤组织的含水量显着低于依达拉奉治疗组（P<0.05）,但与甲强龙治疗组之间无显着差异（P﹥0.05）。与依达拉奉或甲强龙治疗组相比,联合用药组大鼠脊髓损伤组织中神经细胞凋亡率以及Bax、Caspase-3的蛋白表达水平均显着降低（P<0.05）,而Bcl-2的蛋白表达水平显着增高（P<0.05）。结论:依达拉奉和甲强龙联合应用能够抑制大鼠急性脊髓损伤后神经组织水肿,通过下调Bax、Caspase-3和上调Bcl-2的表达水平来降低神经细胞的凋亡率,从而发挥神经保护作用。同时,依达拉奉和甲强龙联合应用还能够减少甲强龙的需要剂量。
二、大鼠急性脊髓损伤后细胞凋亡的时空分布特点（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大鼠急性脊髓损伤后细胞凋亡的时空分布特点（论文提纲范文）
（1）通腑逐瘀法指导下抵当汤加减调控AQP4表达治疗大鼠急性脊髓损伤的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 自制脊髓打击器与NYU打击器建立脊髓损伤模型研究 |
| 1.目的 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 6.不足和展望 |
| 第二部分 抵当汤加减调节AQP4 表达对SCI大鼠脊髓水肿的作用研究 |
| 1.目的 |
| 2.材料 |
| 3.方法 |
| 4.实验结果 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 7.不足与展望 |
| 第三部分 抵当汤加减含药血清对反应性星形胶质细胞的活化、迁移及神经生长相关细胞因子分泌的作用 |
| 1.目的 |
| 2.材料 |
| 3.实验方法 |
| 4.实验结果 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 7.不足和展望 |
| 本研究的创新点 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 附件1 自制简易打击器与NYU打击器 |
| 附件2 脊髓打击损伤模型 |
| 附录3 BBB评分 |
| 附录4 Reuter评分 |
| 附录5 综述 水通道蛋白在急性脊髓损伤中的作用机制 |
| References |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）基于转录组测序研究川芎嗪对大鼠急性脊髓损伤基因表达的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 研究背景 |
| 1 脊髓损伤流行病学 |
| 2 脊髓损伤中西医现状 |
| 2.1 脊髓损伤机制 |
| 2.2 脊髓损伤西医治疗现状 |
| 2.2.1 药物治疗 |
| 2.2.2 细胞移植疗法 |
| 2.2.3 细胞植入生物材料移植 |
| 2.3 脊髓损伤中医现状 |
| 2.3.1 中药相关提取物 |
| 2.3.2 中药复方 |
| 2.3.3 其他 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1 研究材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 实验用品 |
| 1.3.1 耗材 |
| 1.3.2 实验主要仪器 |
| 1.3.3 实验主要仪器试剂及药品 |
| 1.3.4 实验主要溶液及配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验分组 |
| 2.2 建立大鼠急性SCI模型 |
| 2.3 干预方法 |
| 2.4 大鼠神经功能行为学观察 |
| 2.5 标本采集 |
| 2.6 HE、尼氏染色观察 |
| 2.6.1 组织石蜡包埋切片步骤 |
| 2.6.2 HE、尼氏染色前石蜡切片脱蜡至水 |
| 2.6.3 HE染色观察步骤 |
| 2.6.4 尼氏染色观察步骤 |
| 2.6.5 操作注意事项 |
| 2.7 转录组测序流程 |
| 2.8 下机数据分析 |
| 2.8.1 数据整理后过滤 |
| 2.8.2 数据质量检测 |
| 2.8.3 对比分析 |
| 2.8.4 表达量分析 |
| 2.9 表达差异分析 |
| 2.10 生物信息学分析 |
| 3 统计学分析 |
| 第三部分 研究结果 |
| 1 大鼠BBB评分结果 |
| 2 HE、尼氏染色观察结果 |
| 3 转录组测序下机数据分析结果 |
| 3.1 数据整理过滤后统计结果 |
| 3.2 质量检测结果 |
| 3.3 对比分析结果 |
| 3.3.1 对比参考基因组结果 |
| 3.3.2 基因覆盖均一度结果 |
| 3.4 基因表达量分析结果 |
| 4 基因表达差异分析结果 |
| 5 生物信息学分析结果 |
| 5.1 模型组 |
| 5.2 川芎嗪干预组 |
| 5.2.1 B组与C组对比 |
| 5.2.2 C组内对比(C7d-vs-C14d) |
| 第四部分 讨论 |
| 1 SCI模型组 |
| 2 川芎嗪干预急性SCI的现有文献讨论 |
| 3 川芎嗪干预组 |
| 3.1 B7d-vs-C7d |
| 3.2 B14d-vs-C14d |
| 3.3 C7d-vs-C14d |
| 4 本研究不足与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1 随机分组方案 |
| 附录2 BBB评分细则 |
| 综述 脊髓损伤机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）脊髓损伤后环状RNA和长链非编码RNA的表达谱及在星形胶质细胞中的功能初探（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 脊髓损伤后环状RNAs(Circular RNAs)的表达谱及在星形胶质细胞中的功能初探 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 结果 |
| 1.SD大鼠T9半横断模型的建立 |
| 2.CircRNA的类型、数量统计和表达谱 |
| 3.CircRNA的鉴定 |
| 4.脊髓损伤过程中环状RNA表达模式的验证 |
| 5.原代培养星形胶质细胞的鉴定 |
| 6.CircRNA_01477 及其宿主基因的表达模式 |
| 7.CircRNA_01477 的定位 |
| 8.敲降circRNA_01477 对星形胶质细胞增殖的影响 |
| 9.敲降circRNA_01477 对星形胶质细胞迁移的影响 |
| 10.敲降circRNA_01477 对星形胶质细胞凋亡的影响 |
| 11.体内敲降circRNA_01477 对胶质瘢痕的影响 |
| 12.敲降circRNA_01477 芯片杂交分析 |
| 13.敲降circRNA_01477 生物信息学分析和ce RNA网络构建 |
| 14.CircRNA_01477-ce RNA网络验证 |
| 讨论 |
| 第二部分 脊髓损伤后长链非编码RNAs(Long noncoding RNAs)的表达谱及在星形胶质细胞中的功能初探 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 结果 |
| 1.SD大鼠T9半横断模型的建立 |
| 2.LncRNA表达谱及其验证 |
| 3.LOC100909675的特征分析 |
| 4.LOC100909675的全长序列 |
| 5.LOC100909675的定位 |
| 6.敲降LOC100909675对星形胶质细胞增殖的影响 |
| 7.敲降LOC100909675对星形胶质细胞迁移的影响 |
| 8.敲降LOC100909675对星形胶质细胞凋亡的影响 |
| 9.体内敲降LOC100909675对胶质瘢痕的影响 |
| 10.体内敲降LOC100909675对脊髓损伤后肢运动功能的影响 |
| 11.敲降LOC100909675后转录组测序与生物信息学分析 |
| 12.敲降LOC100909675后转录组测序结果验证 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 脊髓损伤与非编码RNA |
| 综述参考文献 |
| 英文缩写词表 |
| 博士生期间发表科研论文及学术会议情况 |
| 博士生期间参加科研项目 |
| 致谢 |
（4）2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉在急性脊髓损伤大鼠模型中的神经保护作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 咪唑啉受体(IR)的研究进展 |
| 1.2.1 咪唑啉受体(IR)的简介 |
| 1.2.2 咪唑啉受体(I_2R)的简介 |
| 1.2.3 咪唑啉I_2受体与神经保护功能的关系 |
| 1.3 Nrf2参与中枢神经系统保护作用 |
| 1.4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉在脊髓损伤大鼠模型中的作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 钳夹法脊髓损伤大鼠模型成功建立 |
| 2.3.2 2-BFI的应用有助于脊髓损伤大鼠神经功能恢复 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉在脊髓损伤大鼠模型中的作用机制 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验所使用的试剂及生产厂家 |
| 3.2.3 实验所使用的主要仪器和生产厂家 |
| 3.2.4 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 2-BFI增加脊髓损伤局部组织抗氧化酶活性 |
| 3.3.2 2-BFI增加脊髓损伤组织抗凋亡水平,抑制细胞坏死 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉在脊髓损伤大鼠模型中神经保护作用的调节机制 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验所使用的试剂及生产厂家 |
| 4.2.3 实验所使用的主要仪器和生产厂家 |
| 4.2.4 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 2-BFI通过激活核转录因子-E2相关因子/血红素加氧酶(Nr2/HO-1)信号通路保护神经 |
| 4.3.2 2-BFI在神经元细胞及星形胶质细胞内激活核转录因子-E2相关因子/血红素加氧酶(Nrf2/HO-1)信号通路保护神经 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 研究的不足之处 |
| 5.3 展望 |
| 综述（一） 脊髄损伤动物模型 |
| 参考文献 |
| 综述（二） 咪唑啉受体（IR）的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述（三） Nrf2通路研究概况 |
| 参考文献 |
| 英汉主要缩略词表 |
| 在读期间撰写论文及科研情况 |
| 致谢 |
（5）补阳还五汤对急性脊髓损伤大鼠NLRP1/Caspase-1细胞焦亡通路的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述1. NLRP1炎性小体在创伤性中枢神经损伤中的作用 |
| 1. NLRP1炎性小体的结构 |
| 2. 创伤性中枢神经损伤诱导NLRP1炎性小体的表达 |
| 3. 创伤性中枢神经损伤中NLRP1炎性小体的激活和调节 |
| 4. 创伤性中枢神经损伤后针对NLRP1炎性小体的治疗 |
| 4. 展望 |
| 参考文献 |
| 综述2. 补阳还五汤在脊髓损伤中的研究进展 |
| 1 脊髓损伤病理过程 |
| 2. 补阳还五汤的药理研究 |
| 3. 补阳还五汤在脊髓损伤中的研究 |
| 4. 结语和展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 动物实验 |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物及试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 方法 |
| 1.5 实验指标测定 |
| 1.6 统计学方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 大鼠BBB评分结果 |
| 2.2 各组大鼠NLRP1、Caspase-1及IL-18蛋白的Western Blot法检测结果 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 实验动物的选择以及脊髓损伤模型的制备 |
| 3.2 大鼠运动功能评价方法 |
| 3.3 补阳还五汤对急性上颈髓损伤大鼠的运动功能评分(BBB评分)的影响 |
| 3.4 补阳还五汤对急性上颈髓损伤大鼠脊髓组织中NLRP1、Caspase-1及IL-18表达的影响 |
| 4. 小结 |
| 4.1 创新性 |
| 4.2. 不足与展望 |
| 5. 结论 |
| 参考文献: |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）Miro1在脊髓损伤中抑制神经元凋亡及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 序言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 :脊髓损伤动物模型的建立及评价 |
| 一.引言 |
| 二.材料与方法 |
| 三.结果 |
| 四.讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 :Miro1在大鼠脊髓损伤不同时间段的变化 |
| 一.引言 |
| 二.材料与方法 |
| 三.结果 |
| 四.讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 :Miro1在脊髓损伤中对神经元凋亡的抑制及其机制探讨 |
| 一.引言 |
| 二.材料与方法 |
| 四.讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 :慢病毒载体注射致Miro1过表达对改善脊髓损伤预后的探讨 |
| 一.引言 |
| 二.材料与方法 |
| 三.结果 |
| 四.讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 综述 线粒体相关蛋白在神经元细胞凋亡中作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略语及注释 |
| 攻读博士学位期间公开发表的论文及科研成果 |
| 致谢 |
（7）补肾活血方通过Notch通路促进血管新生对脊髓损伤的修复作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 脊髓损伤概况 |
| 1.1.1 脊髓的基本结构与解剖 |
| 1.1.2 脊髓损伤的定义及临床表现 |
| 1.1.3 脊髓损伤的流行病学 |
| 1.1.4 脊髓损伤的发病因素 |
| 1.1.5 急性脊髓损伤动物模型 |
| 1.2 急性脊髓损伤发病机制 |
| 1.2.0 脊髓组织中微循环血管的破坏与血管新生 |
| 1.2.1 炎症反应 |
| 1.2.2 氧化应激反应 |
| 1.2.3 神经细胞的自噬、凋亡 |
| 1.2.4 血-脊髓屏障损害 |
| 1.2.5 胶质瘢痕的形成 |
| 1.3 脊髓血管造影中的应用与血管新生的相关机制研究 |
| 1.3.1 micro-CT在脊髓血管造影中的应用 |
| 1.3.2 血管新生相关因子 |
| 1.4 中医对急性脊髓损伤病机的认识 |
| 1.5 中医对急性脊髓损伤的治疗 |
| 第二章 NOTCH调控VEGF、ANG-1/TIE-2等信号通路参与脊髓损伤后血管新生机制的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要实验仪器与设备 |
| 2.1.3 主要试剂与耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验分组设计 |
| 2.2.2 急性脊髓损伤动物模型的建立及护理 |
| 2.2.3 BBB评分 |
| 2.2.4 组织病理形态学检测 |
| 2.2.5 microfil血管灌注实验 |
| 2.2.6 Western blot |
| 2.2.7 micro-CT扫描 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 脊髓损伤后行为学评分BBB评分 |
| 2.3.2 HE病理染色 |
| 2.3.3 CD31荧光染色评价大鼠SCI后脊髓血管面积 |
| 2.3.4 microfil血管造影评价SCI后脊髓血管密度 |
| 2.3.5 脊髓损伤后血管新生及Notch-1等相关因子蛋白的表达情况 |
| 2.3.6 星形胶质细胞在脊髓损伤后的活化情况 |
| 2.3.7 脊髓损伤后神经元出现损伤 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 SCI模型中,前期BBB评分恢复较快,后期神经功能的康复成为难点 |
| 2.4.2 脊髓损伤后机体出现代偿性血管新生 |
| 2.4.3 Notch调控VEGF、Ang-1/Tie-2信号通路参与脊髓损伤后的血管新生 |
| 2.4.4 脊髓损伤后星形胶质细胞出现活化 |
| 2.4.5 脊髓损伤后神经元出现凋亡 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 NOTCH-1和EGFL-8蛋白对血管形成及神经保护的作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞 |
| 3.1.2 主要实验仪器与设备 |
| 3.1.3 主要试剂与耗材 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 MTS实验检测细胞活性 |
| 3.2.2 细胞划痕和tranwell实验 |
| 3.2.3 HUVEC细胞管腔形成(tube formation)实验 |
| 3.2.4 细胞免疫荧光实验 |
| 3.2.5 蛋白印迹实验 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 Notch-1蛋白对HUVEC血管内皮细胞的影响 |
| 3.3.2 Notch-1蛋白对Schwann细胞的影响 |
| 3.3.3 EGFL-8蛋白对HUVEC血管内皮细胞的影响 |
| 3.3.4 EGFL-8蛋白对Schwann cell的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 Notch信号通路与血管新生及神经保护功能 |
| 3.4.2 EGFL-8蛋白对HUVEC血管内皮细胞和Schwann细胞的影响 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 补肾活血方通过NOTCH促进血管新生对急性脊髓损伤的修复作用及机制研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物和细胞 |
| 4.1.2 主要实验仪器与设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 补肾活血方的制备 |
| 4.2.2 HUVEC的培养 |
| 4.2.3 MTS实验检测细胞活力 |
| 4.2.4 BSHXF干预细胞后对HUVEC划痕和transwell迁移实验的影响 |
| 4.2.5 BSHXF对HUVEC细胞管腔形成的影响 |
| 4.2.6 鸡胚绒毛尿囊膜模型(CAM) |
| 4.2.7 BSHXF对胚体外置明胶海绵血管新生的影响 |
| 4.2.8 动物实验分组 |
| 4.2.9 急性脊髓损伤动物模型的建立及护理(同前) |
| 4.2.10 BBB行为学评分 |
| 4.2.11 组织病理形态学检测(同前) |
| 4.2.12 microfil血管灌注(同前) |
| 4.2.13 Western blot免疫印迹实验 |
| 4.2.14 脊髓组织中ROS活性的检测 |
| 4.2.15 RT-PCR |
| 4.2.16 micro-CT扫描(同前) |
| 4.2.17 统计学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 BSHXF对HUVEC细胞的毒性实验 |
| 4.3.2 BSHXF促进HUVECs划痕愈合 |
| 4.3.3 BSHXF对HUVEC细胞在transwell小室中迁移的影响 |
| 4.3.4 BSHXF促进HUVEC管腔形成 |
| 4.3.5 BSHXF对MAPK信号通路的影响 |
| 4.3.6 BSHXF促进尿囊膜血管新生和诱导血管向明胶海绵长入 |
| 4.3.7 BSHXF可改善脊髓损伤后BBB评分 |
| 4.3.8 脊髓取材外观图 |
| 4.3.9 BSHXF可改善SCI后的病理改变 |
| 4.3.10 CD31免疫荧光染色 |
| 4.3.11 microfil血管造影结果 |
| 4.3.12 BSHXF对Notch-1、VEGF、Ang-1/Tie2和EGFL-8蛋白的影响 |
| 4.3.13 BSHXF对Notch通路、VEGF、Ang-1/Tie2等基因的影响 |
| 4.3.14 补肾活血方对脊髓损伤后ROS的影响 |
| 4.3.15 补肾活血方对星形胶质细胞的影响 |
| 4.3.16 补肾活血方对脊髓损伤后神经元的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 补肾活血方具有促进血管新生的作用 |
| 4.4.2 补肾活血方通过血管新生对脊髓损伤的治疗作用 |
| 4.4.3 补肾活血方促进脊髓损伤后血管新生的机制 |
| 4.4.4 补肾活血方减轻脊髓损伤后氧化应激反应 |
| 4.4.5 补肾活血方对脊髓损伤后神经细胞的影响 |
| 4.5 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 《土大黄苷通过NFATcl和R0S通路抑制破骨细胞分化和骨吸收功能》 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 附件 |
| 致谢 |
（8）电针大椎穴、命门穴对脊髓损伤大鼠PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 大椎穴、命门穴临床治疗神经系统疾病研究进展 |
| 1 脑卒中 |
| 2 认知功能障碍 |
| 3 阿尔兹海默病 |
| 4 颈椎病 |
| 5 脊髓损伤 |
| 6 腰椎间盘突出症 |
| 7 小儿脑性瘫痪 |
| 8 其他 |
| 9 小结 |
| 综述二 人体神经系统PI3K/AKT/mTOR信号通路研究进展 |
| 1 PI3K/AKT/mTOR信号通路概况 |
| 2 PI3K/AKT/mTOR信号通路的调控作用 |
| 3 PI3K/AKT/mTOR信号通路与神经系统 |
| 4 小结 |
| 综述三 脊髓损伤临床治疗进展 |
| 1 手术 |
| 2 升高血压 |
| 3 干细胞移植 |
| 4 药理学治疗 |
| 5 中医药 |
| 6 运动训练 |
| 7 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 实验研究 |
| 实验一 电针大椎穴、命门穴对脊髓损伤模型大鼠肢体功能的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结与讨论 |
| 实验二 电针大椎穴、命门穴对脊髓损伤模型大鼠受损脊髓的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结与讨论 |
| 实验三 电针大椎穴、命门穴对脊髓损伤模型大鼠mTOR的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结与讨论 |
| 实验四 电针大椎穴、命门穴对脊髓损伤模型大鼠PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结与讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
（9）放射性脑和视神经损伤的功能磁共振研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 第一部分 急性放射性脑损伤的多模态MRI评估 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 放射性脑损伤海马中炎症小体、细胞凋亡及MEMRI的变化 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 锰离子增强MRI监测放射性视神经损伤轴突运输功能 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 锰离子增强磁共振在中枢神经系统疾病研究中的应用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（10）依达拉奉联合甲强龙对大鼠急性脊髓损伤后神经组织的保护作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.2.1 实验对象 |
| 2.2.2 实验分组 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大鼠急性脊髓损伤模型建立 |
| 2.3.2 药物干预 |
| 2.3.3 BBB评分 |
| 2.3.4 标本获取 |
| 2.3.5 水肿指标检测 |
| 2.3.6 石蜡切片制作 |
| 2.3.7 标本总蛋白提取 |
| 2.3.8 Western blot |
| 2.3.9 TUNEL实验 |
| 2.3.10 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 EDA和MP能改善大鼠脊髓损伤后肢体运动功能 |
| 3.2 EDA和MP能减轻大鼠脊髓损伤后脊髓组织水肿 |
| 3.3 EDA和 MP均显着地上调了大鼠急性脊髓损伤组织中抗凋亡因子Bcl-2 的表达水平,下调了促凋亡因子Bax和 Caspase-3 的表达水平 |
| 3.4 EDA和MP均能够显着地降低大鼠急性脊髓损伤组织中神经细胞的凋亡率,EDA与MP联合治疗时抗凋亡作用更加显着 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究结果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
四、大鼠急性脊髓损伤后细胞凋亡的时空分布特点（论文参考文献）
- [1]通腑逐瘀法指导下抵当汤加减调控AQP4表达治疗大鼠急性脊髓损伤的作用机制研究[D]. 吴子健. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [2]基于转录组测序研究川芎嗪对大鼠急性脊髓损伤基因表达的影响[D]. 张毅. 广西中医药大学, 2020(02)
- [3]脊髓损伤后环状RNA和长链非编码RNA的表达谱及在星形胶质细胞中的功能初探[D]. 巫荣华. 苏州大学, 2020(06)
- [4]2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉在急性脊髓损伤大鼠模型中的神经保护作用及其机制研究[D]. 林小龙. 苏州大学, 2020(06)
- [5]补阳还五汤对急性脊髓损伤大鼠NLRP1/Caspase-1细胞焦亡通路的影响[D]. 李亚锋. 北京中医药大学, 2020(04)
- [6]Miro1在脊髓损伤中抑制神经元凋亡及其机制研究[D]. 赵磊. 苏州大学, 2020(06)
- [7]补肾活血方通过Notch通路促进血管新生对脊髓损伤的修复作用及机制研究[D]. 何剑波. 广州中医药大学, 2020(06)
- [8]电针大椎穴、命门穴对脊髓损伤大鼠PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响[D]. 李可. 北京中医药大学, 2020(04)
- [9]放射性脑和视神经损伤的功能磁共振研究[D]. 杨军. 昆明医科大学, 2020(02)
- [10]依达拉奉联合甲强龙对大鼠急性脊髓损伤后神经组织的保护作用研究[D]. 张富荣. 中国医科大学, 2020(01)