一、UROTENSIN II RECEPTOR IN THE RAT AIRWAY SMOOTH MUSCLE AND ITS EFFECT ON THE RAT AIRWAY SMOOTH MUSCLE CELLS PROLIFERATION（论文文献综述）
朴艺花[1]（2021）在《TGF-β1-TAK1-AMPKα激活PINK1-Parkin通路介导线粒体自噬调控气道平滑肌细胞增殖及对哮喘气道重构的影响》文中研究表明背景:哮喘是一种常见的呼吸系统过敏性疾病,其中炎症细胞（如嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞等）和气道结构细胞（如上皮细胞、平滑肌细胞）等在哮喘的发病过程中发挥重要作用。炎症细胞释放炎症介质导致气道持续慢性炎症,引起气道结构的改变,包括上皮完整性丧失、基底膜增厚或上皮下纤维化、粘液腺和杯状细胞增生、平滑肌细胞肥大、增生或迁移导致平滑肌质量增加,气道血管分布增加,导致气道重构,气道平滑肌质量增加是哮喘气道重构的标志性改变。近年来研究表明,转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）可诱导人气道平滑肌（human airway smooth muscle,h ASM）细胞有丝分裂/增殖。并且在卵清蛋白（ovalbumin,OVA）、屋尘螨（house dust mites,HDM）、脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）和甲苯二异氰酸酯致敏和重复激发引起小鼠模型中,气道平滑肌（airway smooth muscle,ASM）组织增大与TGF-β1表达增加和信号转导同时发生。自噬是真核细胞对受损蛋白质或细胞器包裹进行溶酶体降解和再循环,具有多重效果维持细胞核机体稳态的一个过程。研究表明自噬在哮喘呼吸道感染中发挥重要作用。线粒体自噬是自噬对线粒体的选择性降解。它通常发生在暴露于环境污染物、过敏原或应激后受损的线粒体中,并在促进线粒体更新和防止功能障碍的线粒体蓄积中发挥关键作用。线粒体功能障碍和活性氧（reactive oxygen species,ROS）产生增加与过敏性疾病有关,包括特应性皮炎和哮喘。TGF-β1被认为通过激活平滑肌细胞驱动气道重构,随后诱导纤维化细胞外基质（extracellular matrix,ECM）蛋白的释放。人哮喘肺中ASM厚度的增加与自噬标记物的高表达密切相关,这一关联在非哮喘人中并不存在。最近研究表明自噬促进并影响TGF-β1驱动的气道重构。但TGF-β1对线粒体自噬的影响还未被深入的研究,TGF-β1通过线粒体自噬调节ASMC细胞增殖和细胞功能以及其在气道重构中的作用还没有被阐述。本研究利用ASMC细胞观察TGF-β1对线粒体自噬的影响并对其作用机制进行探讨和阐述,确定TGF-β1诱导线粒体自噬对ASMC细胞增殖和细胞功能的影响。体内实验利用哮喘气道重构模型,观察哮喘气道重构模型小鼠体内TGF-β1对TAK1-AMPKα信号转导的影响,以及随后PINK1/Parkin激活介导线粒体自噬是否存在。目的:阐明TGF-β1通过TAK1-AMPKα激活PINK1-Parkin通路调控线粒体自噬调介导气道平滑肌细胞增殖的作用机制,探讨该机制在哮喘气道重构中的作用,为临床哮喘的治疗提供新的作用靶点。方法:第一部分:体外实验复苏大鼠气道平滑肌细胞-RASMC细胞,分别使用SB505124、TAKinib、3-MA、CQ预处理RASMC细胞,si RNA干扰AMPKα、PINK1、Parkin表达,再使用TGF-β1按照需要使用不同浓度或不同时间刺激RASMC细胞。观察指标:1)MTT法检测TGF-β1对RASMC细胞活力;2)RT-q PCR方法检测TGF-β1、TAK1、PINK1、Parkin的含量,并验证si PINK1、si Parkin、si AMPKα效果;3)小干扰RNA沉默PINK1、Parkin、AMPKα表达;4)Western Blot方法检测RASMC细胞中TGF-β1、p-TAK1、TAK1、p-AMPKα、AMPKα、PINK1、mito-PINK1、cyto-PINK1、Parkin、mito-Parkin、cyto-Parkin、LC3-I/II、Beclin-1、Atg5、Atg7、p62、PCNA、α-SMA、MMP9、Drp1、Fis1、MFN2、OPA1、OPTN、NDP52蛋白的表达;5)CCK-8实验检测RASMC细胞增殖;6)流式细胞术检测RASMC细胞周期、线粒体膜电位变化、ROS释放;7)细胞染色:应用AO染料、TMRE试剂、JC-1试剂、Mitosox试剂、Mitotraker-red试剂等对RASMC细胞染色;8)细胞免疫荧光检测RASMC细胞中PINK1、Parkin的表达。第二部分:体内实验32只BALB/C小鼠随机分成4组,分别为正常对照组（control组）、哮喘气道重构模型组（OVA组）、TGF-β1抑制剂处理组（OVA+SB505124组）、自噬抑制剂处理组（OVA+CQ组）。除正常组外其余组小鼠建立哮喘气道重塑模型,各抑制剂组分别给予相应的干预手段。观察指标:1)利用Ach呼吸激发实验检测小鼠气道反应性;2)ELISA方法检测小鼠BALF中TGF-β1的含量;3)RT-q PCR方法检测肺组织中TGF-β1的含量;4)小鼠肺组织进行HE、PAS及Masson染色;5)BALF中TGF-β1含量、肺组织中TGF-β1的m RNA水平与气道平滑肌厚度相关性;6)免疫组织化学染色检测小鼠肺组织中α-SMA、MMP-9表达水平;7)Western blot方法检测小鼠肺组织中TGF-β1、p-TAK1、TAK1、p-AMPKα、AMPKα、PINK1、Parkin、LC3-I/II、Beclin-1、Atg5、Atg7、p62、PCNA、α-SMA、MMP9蛋白表达。结果:第一部分:体外实验1.TGF-β1可以诱导RASMC细胞中PINK1及Parkin高表达,10ng/ml的TGF-β1刺激时PINK1、Parkin蛋白水平及m RNA水平升高为最显着。经TGF-β1受体抑制剂SB505124处理细胞,可以抑制TGF-β1诱导的PINK1、Parkin蛋白高表达及m RNA高水平。2.TGF-β1可以诱导RASMC细胞中PINK1和Parkin在线粒体中高表达,而在胞浆中低表达。TGF-β1受体抑制剂SB505124能明显增加PINK1和Parkin在胞浆表达,减少在线粒体中表达。3.TGF-β1可以诱导RASMC细胞线粒体膜电位下降,荧光显微镜下可以观察荧光强度的减弱,同时诱导细胞总ROS水平及线粒体ROS水平升高,荧光强度增强。经应用TGF-β1受体抑制剂SB505124后上述现象被抑制。4.TGF-β1可以诱导RASMC细胞中线粒体分裂相关蛋白Drp1和Fis1及接头分子蛋白OPTN和NDP52的高表达,但抑制线粒体融合相关蛋白OPA1和MFN2的表达。经应用TGF-β1受体抑制剂SB505124后可逆转上述变化。5.TGF-β1可以诱导RASMC细胞中线粒体形态发生改变,纤维状形态转变为截短甚至碎片化的分裂表型。经应用TGF-β1受体抑制剂SB505124后可逆转上述变化。6.TGF-β1可以诱导自噬相关蛋白LC3 II/LC3 I、Beclin-1、Atg5和Atg7蛋白表达水平升高,减少降解底物p62蛋白表达。经TGF-β1受体抑制剂SB505124处理细胞,可以把TGF-β1诱导的LC3II/LC3I、Beclin-1、Atg5和Atg7蛋白高表达下调,并上调p62蛋白水平。7.沉默PINK1及Parkin基因表达,可以明显逆转TGF-β1刺激所升高的LC3II/LC3I、Beclin-1、Atg5和Atg7的表达及减少的p62表达。8.自噬抑制剂CQ能够明显增强TGF-β1诱导自噬相关蛋白LC3I/II、Beclin-1、Atg5和Atg7的表达。同时TGF-β1诱导p62降解明显受到CQ的抑制,导致降解底物p62增多。9.TGF-β1可以诱导RASMC细胞增殖,并影响RASMC细胞周期,使S期和G2/M期延长。TGF-β1受体抑制剂SB505124和自噬抑制剂3-MA可以逆转以上变化。10.TGF-β1可以诱导RASMC细胞增殖相关蛋白PCNA、α-SMA、MMP9的高水平,TGF-β1受体抑制剂SB505124和自噬抑制剂3-MA可以逆转以上变化。11.TGF-β1可以促进RASMC细胞迁移能力,能明显减少细胞划痕的距离,增加细胞迁移能力,而TGF-β1受体抑制剂SB505124和自噬抑制剂3-MA处理后能明显降低细胞的迁移能力。12.小干扰RNA沉默PINK1、Parkin,RASMC细胞增殖、PCNA、a-SMA和MMP-9蛋白表达均明显降低,同时降低S期和G2/M期百分比。13.TGF-β1不能诱导TAK1蛋白的表达,但能够明显提高p-TAK1的表达,而且TGF-β1受体抑制剂SB505124同样对TAK1无影响,但能抑制p-TAK1的表达。14.TGF-β1可以诱导RASMC细胞AMPKα磷酸化水平同时诱导PINK1和Parkin高表达,但提高的磷酸化AMPKα被TGF-β1受体抑制剂或TAK1抑制剂所阻断。同样,TGF-β1诱导高表达的PINK1和Parkin被TAK1抑制剂所降低。第二部分:体内实验1.哮喘气道重构模型小鼠肺组织中TGF-β1呈高表达,TAK1和AMPKα磷酸化水平明显提高。TGF-β1受体抑制剂组这些蛋白水平均受抑制。2.哮喘气道重构模型小鼠肺组织中PINK1、Parkin呈高表达,但抑制剂组起蛋白水平明显下降。3.哮喘气道重构模型小鼠BALF中及肺组织TGF-β1的m RNA水平升高,其水平与气管平滑肌厚度呈正相关。4.TGF-β1抑制剂组减轻OVA诱导的哮喘气道重构小鼠气道内炎症细胞的浸润、破坏肺内组织结构、促进杯状细胞增生、粘液分泌及纤维化。5.TGF-β1抑制剂组可以下调OVA诱导的哮喘气道重构小鼠肺组织中自噬相关蛋白LC3I/II、Beclin-1、Atg5和Atg7的表达,而自噬抑制剂CQ组能够明显增强TGF-β1诱导自噬相关蛋白LC3I/II、Beclin-1、Atg5和Atg7的表达。同时TGF-β1诱导p62降解明显受到CQ的抑制,导致降解底物p62增多。6.TGF-β1抑制剂组及自噬抑制剂CQ组均可以抑制哮喘气道重构小鼠模型肺组织中平滑肌增殖蛋白的表达。7.TGF-β1抑制剂组及自噬抑制剂CQ组均可以减轻气道高反应性。结论:1.TGF-β1通过活化TAK1和AMPKα激活PINK1-Parkin通路介导线粒体自噬,并且TGF-β1所介导的自噬参与调节RASMC细胞增殖及细胞功能。2.TGF-β1通过TAK1-AMPKα信号轴激活PINK1-Parkin通路介导自噬促进哮喘气道重构。3.靶向调节TGF-β1介导线粒体自噬可能治疗哮喘气道重构的一个新策略。
杨二兰[2]（2020）在《马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱的合成及其抗哮喘和抗炎活性研究》文中进行了进一步梳理马齿苋（Portulaca oleracea L.）为马齿苋科一年生肉质草本植物,可药食两用,具有清热解毒、凉血止血、止痢的功效。现代药理研究表明马齿苋具有抗菌、抗炎、镇痛、镇静、抗哮喘、舒张骨骼肌、降血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老、神经保护等多方面活性。《本草经疏》言马齿苋“能散肺家之热”,以马齿苋为主药,佐以清热化痰之品,可治疗肺脓肿（肺痈）、肺炎、急慢性支气管炎、化脓性支气管炎、小儿百日咳、肺结核咳嗽、慢性咳嗽等肺系病证属痰热壅肺咳喘者,伊朗传统医药记载马齿苋可治疗哮喘等呼吸系统疾病。此外,临床试验及动物实验表明马齿苋具有抗哮喘作用。上述结果提示马齿苋具有抗哮喘应用基础,并具备发现抗哮喘创新药物的潜力,目前马齿苋平喘作用研究仅局限于水煮液,其激动β2-AR抗哮喘活性成分尚不明确,有待深入研究。一、马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱及其衍生物的合成及纯化本课题组前期发现马齿苋中一系列结构新颖的水溶性儿茶酚型异喹啉类生物碱,包括四氢异喹啉类生物碱（Tetrahydroisoquinolines,THIQs）,具有不同程度的体外激动β2-AR和抗炎双功能,推测其可能是马齿苋抗哮喘的潜在药效物质基础。然而,由于这些化合物从天然产物中提取分离所得含量通常很低,造成后续体内药理活性研究无法深入展开,化学合成方法成为制备儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱的关键手段。本文以盐酸多巴胺和醛为反应底物,采用条件温和的磷酸盐介导的Pictet-Spengler反应合成了马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉生物碱1、2、12及其系列衍生物,共14个化合物（1-14）,其中14为新化合物,除产物1、3、4、5、8、12、13外,其余7个生物碱均为首次通过磷酸盐介导的Pictet-Spengler反应仿生合成。由于现存分离纯化方法的局限性,从水溶性反应体系（含磷酸盐、维生素C以及未反应完全的盐酸多巴胺）中大量分离纯化水溶性儿茶酚型THIQs产物成为本实验面临的一个严峻挑战。本实验首次发现利用AB-8大孔吸附树脂柱色谱,首先采用水洗脱可除去磷酸盐和维生素C等水溶性成分,然后采用乙醇洗脱可实现目标THIQs与未反应完全的底物多巴胺的分离,从而制备得到纯化的THIQs。大孔吸附树脂柱色谱法为实现磷酸盐介导的水溶性儿茶酚型THIQs的高效分离纯化提供了一种简便、绿色、环保、通用的新方法。二、马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱抗哮喘活性研究本文利用稳定表达α1B-AR、β1-AR和β2-AR的CHO-K1/Gα15中国仓鼠卵巢细胞模型,分别以肾上腺素和异丙肾上腺素作为阳性激动药物,通过钙流检测,考察了马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱及本实验合成的衍生物在100 μM时对β2-AR的激动作用及其对α1B-AR、β1-AR和β2-AR的选择性,并探讨了构效关系。首次发现12具有很强的β2-AR激活作用,但其对β1-AR亚型亦具有较好的激动活性;化合物2及本课题组前期制备的马齿苋酰胺E（oleracein E,OE）为选择性β2-AR激动剂,其对α1B-AR、β1-AR的作用弱。在此基础上,本文利用磷酸组胺诱导的豚鼠离体气管螺旋条收缩模型,发现马齿苋中β2-AR激动剂12、2和OE能够剂量依赖性地舒张气管,其解痉百分率的EC50值分别为0.8、2.8和7.0 μM,12、2和OE在低浓度时的气管舒张作用可被β受体阻断剂盐酸普萘洛尔阻断。上述三个化合物按照摩尔比1:1:1混合时在低浓度范围内（0.01 μM～1 μM）可协同止痉,作用强于单个化合物,但在高浓度（大于1 μM）时可能产生竞争性抑制,提示马齿苋抗哮喘作用可能是儿茶酚型异喹啉类生物碱协同作用的结果。本文进一步利用超声雾化组胺诱导的豚鼠化学刺激性急性哮喘气道痉挛模型,发现12在10、20、40 mg/Kg时能剂量依赖性地显着延长豚鼠的引喘潜伏期（p<0.05,p<0.01,p<0.01）,而且抽搐跌倒的豚鼠只数呈剂量依赖性下降趋势。2仅在高浓度（40、80 mg/Kg）时能剂量依赖性地显着延长豚鼠的引喘潜伏期（p<0.01）,OE仅在高浓度（80、160mg/Kg）时能剂量依赖性地显着降低豚鼠的引喘潜伏期（p<0.05,p<0.01）,2和OE对豚鼠抽搐跌倒的只数影响很小或无作用。上述结果表明马齿苋中的儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱对组胺喷雾致豚鼠哮喘模型具有抗气道痉挛作用,其作用强弱依次为12>2>OE,与12、2、OE在组胺诱导的豚鼠离体气管螺旋条平滑肌收缩模型中的支气管舒张作用强弱一致。进一步地,本文利用卵白蛋白（OVA）诱导的过敏性哮喘小鼠气道炎症模型,发现12虽然有剂量依赖性降低血液中嗜酸性粒细胞的趋势,但各剂量组与OVA模型组相比均无显着性差异（p>0.05）。12仅在高剂量80 mg/Kg具有抗气道炎症作用,其显着降低了过敏性哮喘小鼠BALF上清液中IL-1β、IL-5、IL-13含量（p<0.05 或p<0.01）,分别降低了 34.64%、23.40%、37.63%,但对 BALF 中 TNF-α的含量无显着性影响（p>0.05）;中低剂量（5、20mg/Kg）的12无抗炎作用（p>0.05）。三、马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱12和2对脂多糖诱导脓毒症小鼠模型的抗炎活性研究本文通过测定血浆中NO、IL-6以及TNF-α以及BALF中IL-6、TNF-α等炎性因子指标,进一步评价了马齿苋中具有平喘作用的儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱12、2是否对LPS诱导脓毒症小鼠模型具有抗炎作用。结果表明,单剂量腹腔注射LPS会造成昆明小鼠眼睑分泌物增多、精神萎靡、活动减少,与空白对照组相比,两次造模的脓毒症小鼠模型血浆NO（p<0.05或p<0.0001）、TNF-α（p<0.0001）和 IL-6（p<0.0001）以及 BALF 上清液中 TNF-α（p<0.01）和 IL-6（p<0.01或p<0.05）炎性因子水平均显着升高。各剂量12组对脓毒症小鼠血浆NO的过量释放均无显着影响（p>0.05）。12仅在高剂量80 mg/Kg时显着降低了脓毒症小鼠血浆和 BALF 中 TNF-α（p<0.01,p<0.05）以及 IL-6（p<0.01,p<0.05）的含量,分别降低了 65.16%、56.54%、73.53%和54.75%;但中低剂量的12均无显着影响（p>0.05）。中低剂量的2对脓毒症小鼠血浆和BALF上清液中TNF-α和IL-6的含量均无显着影响（p>0.05）,2仅在高剂量（80 mg/Kg）显着降低了血浆和BALF中 TNF-α（p<0.01,p<0.05）以及 IL-6（p<0.05,p<0.05）的含量,分别降低了48.57%、54.62%、46.65%、62.09%。上述结果表明 12 和 2 在 80 mg/Kg 时对 LPS诱导的脓毒症小鼠具有一定抗炎作用。
刘冬立[3]（2020）在《TRPV4在高肺血流性肺动脉高压肺血管重构中的作用及机制探究》文中研究表明第一部分TRPV4在高肺血流性肺动脉高压肺动脉平滑肌细胞中的表达及其对肺动脉平滑肌细胞增殖及迁移的影响目的:研究瞬时感受器电位离子通道香草素受体亚家族4（Transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4）在高肺血流性肺动脉高压（Pulmonary arterial hypertension,PAH）大鼠肺动脉平滑肌细胞（Pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs）中的表达,探讨TRPV4对PAH大鼠PASMCs迁移和增殖的影响。方法:30只SD大鼠随机分为正常对照组、假手术组及分流组。通过对大鼠实施腹主动脉-下腔静脉分流手术建立高肺血流性PAH动物模型。经B超检查、导管测定右心室压力（Right ventricular pressure,RVP）及测量右心室肥厚指数（Right ventricular hypertrophy index,RVHI）,肺组织切片H&E染色验证动物模型。采用Real-time PCR、Western Blot方法研究TRPV4在高肺血流性PAH大鼠PASMCs中的表达。通过小干扰RNA技术沉默TRPV4基因在PASMCs中的表达,并通过Real-time PCR、Western Blot方法验证沉默效率。运用细胞划痕实验、细胞增殖活性检测,研究TRPV4沉默对PASMCs迁移和增殖的影响。结果:（1）经B超检查、导管测定RVP及测量RVHI,肺组织切片H&E染色,证实PAH大鼠模型建立成功;（2）与正常对照组及假手术组相比,TRPV4mRNA及蛋白的相对表达量在分流组大鼠的PASMCs中表达显着升高,差异均有统计学意义（p<0.05）;（3）慢病毒干扰载体（LV-TRPV4-RNAi）转染PAH大鼠PASMCs后,成功下调TRPV4在PASMCs中的表达;（4）分流组及阴性对照病毒转染组PASMCs增殖活性及迁移能力显着高于正常对照组,差异均有统计学意义（p<0.05）。而LV-TRPV4-RNAi转染组PASMCs增殖活性及迁移能力较分流组、阴性对照病毒转染组均显着下降,差异均有统计学意义（p<0.05）;（5）分流组及阴性对照病毒转染组PASMCs中增殖细胞核抗原（Proliferation cell nuclear antigen,PCNA）蛋白相对表达量较正常对照组显着增高,差异均有统计学意义（p<0.05）。而LV-TRPV4-RNAi转染组PASMCs中PCNA表达较分流组、阴性对照病毒转染组明显下调,差异均有统计学意义（p<0.05）。结论:（1）TRPV4在高肺血流性PAH大鼠PASMCs中存在高表达;（2）沉默TRPV4的表达,PASMCs的增殖活性及迁移能力均受到抑制。第二部分TRPV4表达下调对高肺血流性肺动脉高压肺血管重构的影响目的:通过腺相关病毒干扰载体（rAAV6-TRPV4-RNAi）介导TRPV4基因在高肺血流性PAH大鼠肺组织中表达下调,研究TRPV4对肺动脉高压大鼠肺血管重构的作用。方法:40只SD大鼠随机分为正常对照组、分流组、阴性对照病毒感染组及rAAV6-TRPV4-RNAi感染组。通过对大鼠实施腹主动脉-下腔静脉分流手术建立高肺血流性PAH动物模型,使用rAAV6-TRPV4-RNAi在体感染PAH模型大鼠,沉默TRPV4在大鼠肺组织中的表达。通过测量RVP及RVHI,肺组织H&E染色、弹力纤维染色、马松染色评估肺血管血流动力学、肺血管重塑及右心室重构情况,Western Blot检测PCNA在各组肺动脉组织中的表达。结果:（1）成功建立PAH大鼠模型,经气道注射rAAV6-TRPV4-RNAi在体感染大鼠,有效介导了TRPV4在大鼠肺组织中表达下调;（2）rAAV6-TRPV4-RNAi感染组RVP及RVHI较分流组及阴性对照病毒感染组均显着下降,差异均有统计学意义（p<0.05）;（3）大鼠肺组织切片H&E染色结果显示,正常对照组大鼠肺小动脉结构清晰,管壁无增厚,中膜无增生肥厚,管腔通畅无狭窄。分流组及阴性对照病毒感染组大鼠肺小动脉管壁明显增厚,中膜增生肥厚,管腔狭窄,部分接近闭塞。rAAV6-TRPV4-RNAi感染组大鼠肺小动脉管壁稍增厚,中膜增生肥厚程度较分流组及阴性对照病毒感染组轻,未见动脉官腔闭塞;（4）分流组、阴性对照病毒感染组血管壁肌层厚度占外径的百分比（Ratio of vascular wall thickness/vascular external diameter,WT%）及肺小血管纤维化程度较正常对照组明显升高,差异均有统计学意义（p<0.05）,rAAV6-TRPV4-RNAi感染组WT%及肺小血管纤维化程度较分流组和阴性对照病毒感染组均显着下降,差异均有统计学意义（p<0.05）;（5）分流组及阴性对照病毒感染组肺动脉组织中PCNA蛋白相对表达量较正常对照组显着增高,差异均有统计学意义（p<0.05）。而rAAV6-TRPV4-RNAi感染组大鼠肺动脉组织中PCNA蛋白的相对表达量较分流组、阴性对照病毒感染组明显下调,差异均有统计学意义（p<0.05）。结论:（1）经气道注射rAAV6-TRPV4-RNAi在体感染大鼠,可有效介导TRPV4在大鼠肺组织表达下调;（2）沉默TRPV4在高肺血流性PAH大鼠肺组织中表达,可改善肺动脉血流动力学参数,减轻肺血管重塑及右心室重构,从而延缓PAH进程。第三部分TRPV4影响高肺血流性肺动脉高压肺血管重构的机制目的:通过使用Affymetrix Clariom S基因芯片,对TRPV4特异性r AAV感染组与非感染组PAH大鼠肺动脉组织中差异表达的m RNA进行研究,探索TRPV4调控PASMCs增殖和迁移以及肺血管重塑的作用机制。方法:选取第二部分实验中rAAV6-TRPV4-RNAi感染组及分流组大鼠肺动脉组织为研究对象,使用Affymetrix Clariom S基因芯片检测获得两组肺动脉组织中差异表达基因,对差异表达基因通过基因本体论（Gene ontology,GO）分析及KEGG富集分析筛选TRPV4调节的关键通路。Real-time PCR技术对筛选出的信号通路关键基因进行验证。结果:（1）rAAV6-TRPV4-RNAi感染组与分流组比较,肺动脉组织中差异表达基因共有558个,其中上调基因有320个,下调基因有238个;（2）GO分析结果表明,在生物过程中,与蛋白质稳定化、细胞粘附相关的基因富集度最高。在分子功能中,与细胞外基质结构成分相关的基因富集度最高。在细胞组分中,与黏着斑相关的基因富集度最高。其中与细胞粘附、黏着斑、细胞外基质分泌与合成密切相关的基因如转化生长因子β1（Transforming growth factor beta-1,TGF-β1）、层粘连蛋白β2（Laminin subunit beta 2,LAMB2）、VI型胶原α2链（Collagen type VI alpha 2 chain,COL6A2）、Ras同源物基因家族B（Ras homolog family member B,RHOB）、I型胶原α2（Collagen type I alpha-2,COL1A2）、细胞外基质蛋白1（Extracellular matrix protein 1,ECM1）等在rAAV6-TRPV4-RNAi感染组肺动脉组织中显着下调,下调倍数分别为-1.59、-1.69、-1.76、-2.07、-1.82、-1.60;（3）KEGG分析结果表明,与内质网中的蛋白质加工、PPAR信号通路、PI3K-Akt信号通路相关基因的富集度最高,其中过氧化物酶体增殖物激活型受体γ（Peroxisome proliferator activated-receptors gamma,PPARγ）信号通路在TRPV4沉默的PAH大鼠肺动脉组织中被显着激活;（4）Real-time PCR对PPARγ信号通路中被显着上调的基因如PPARγ、解耦连蛋白1（Uncoupling protein 1,UCP1）、脂滴包被蛋白1（Perilipin 1,PLIN1）、脂肪酸结合蛋白4（Fatty acid binding protein 4,FABP4）进行验证,结果与芯片数据相符。结论:（1）rAAV6-TRPV4-RNAi感染组与分流组相比较,肺动脉组织中差异表达基因主要富集于蛋白质稳定化、细胞粘附、细胞外基质结构成分、黏着斑等GO term,以及与内质网中的蛋白质加工、PPAR、PI3K-Akt等相关信号通路中;（2）TRPV4可能通过调控TGF-β1、LAMB2、COL6A2、RHOB、COL1A2、ECM1的表达,及活化PPARγ信号通路参与对PAH大鼠PASMCs增殖、迁移及肺血管重塑的调控,继而在高肺血流性PAH发生发展过程中发挥重要作用。
崔妮娜[4]（2020）在《华山参滴丸对哮喘的作用机制研究》文中研究说明哮喘是一种气道炎症引起的气管过度收缩,因其难治愈的特点被称为四大顽疾之一。华山参作为传统中药,具有温肺祛痰、平喘止咳的作用,以华山参提取物为原料的华山参滴丸临床应用多年,但其平喘作用机制尚不明确。本论文就华山参滴丸的平喘物质基础及作用机制通过动物模型和离体气管实验展开研究。本文采用HPLC-Q-TOF-MS的方法将华山参滴丸中的成分进行定性分析,在正离子模式下鉴别出1 1种生物碱。通过大鼠给药分析其入血成分,确定阿托品、山莨菪碱和东莨菪碱为华山参滴丸的有效成分。采用卵清蛋白致敏的方法建立过敏性小鼠哮喘模型研究其药效学。通过对小鼠行为学和体重的观察,肺指数和肺泡灌洗液中总蛋白含量的测定,以及对肺组织病理学的分析,结果表明华山参滴丸明显改善哮喘小鼠的行动迟缓,抑制其体重降低,降低肺指数,减少肺部总蛋白,减轻小鼠肺部炎症细胞的浸润,改善气道结构改变和气管收缩现象。本论文通过哮喘动物模型和离体气管组织研究华山参滴丸的平喘机制。通过分子对接与酶联免疫吸附法研究其抑制气道炎症的作用机制,结果表明华山参滴丸明显降低IgE的含量,其有效成分阿托品、山莨菪碱和东莨菪碱对IgE受体有较高的亲和力,可能抑制IgE与其受体的结合,阻止炎症的深化。并且,华山参滴丸通过降低IgE、IL-4、IL-5、ET-1和增加INF-γ的浓度,抑制Th2的过度分化,平衡Thl/Th2减轻气道炎症。除此之外,通过离外气管平滑肌研究其抑制气道高反应的作用机制,结果表明华山参滴丸通过影响KCa离子通道,阻断VDCC和ROCC通道,阻断细胞外Ca2+进入并抑制细胞内Ca2+释放舒张气管平滑肌,降低气道高反应。其中,阿托品、山莨菪碱和东莨菪碱可能发挥主要作用。总之,本论文通过华山参滴丸的入血成分分析确定了其有效成分为阿托品、山莨菪碱和东莨菪碱。通过动物哮喘模型和离体气管组织实验,明确了其平喘机制主要为抑制炎症介质的释放,调节Th1/Th2的平衡减轻气道炎症反应,同时通过控制KCa通道及Ca2+内流和释放的途径舒张气管平滑肌,降低气道高反应。本研究为华山参滴丸的临床应用奠定理论基础。
陈秋仪[5]（2020）在《加减乌梅丸颗粒对哮喘大鼠激素干预模型气道重塑及TGF-β1/Smad通路的影响》文中研究表明研究目的:本研究通过建立哮喘大鼠激素干预模型,运用临床确有疗效的加减乌梅丸颗粒作为治疗药物,评估该药物对模型大鼠TGF-β1/Smad信号通路的影响以及对气道重塑的阻抑作用,阐明加减乌梅丸颗粒阻抑哮喘大鼠激素干预模型气道重塑的作用靶点及作用机制。研究方法:将健康雄性SD大鼠随机分为正常组、哮喘组、地塞米松组、普米克令舒组及中药组,适应性喂养1周,除正常组外,其余各组均于实验第1天和第8天腹腔注射卵蛋白（OVA）与氢氧化铝佐剂混合液致敏,第15天开始以1%OVA隔天雾化激发,除正常组和哮喘组外,其余各组均在雾化激发前给予地塞米松磷酸钠注射液0.5 mg/kg腹腔注射,按每周0.1 mg/kg速度撤减地塞米松的剂量,普米克令舒组予普米克令舒0.413 mg/kg每日雾化吸入,中药组予加减乌梅丸颗粒1.86 g/kg每日灌胃,均用药7周,观察大鼠一般表征,末次给药24 h后取材。（1）比较各组大鼠肺通气功能及气道重塑程度:大鼠麻醉后检测各组肺通气功能,记录用力肺活量（FVC）、0.2秒用力呼气容积（FEV0.2）、0.2秒内的平均流速（FEV0.2/FVC%）、用力最大呼气流速（PEF）、用力中期呼气流速（FEF25-75%）等数据;处死大鼠后取部分左肺组织固定、石蜡包埋切片,行HE和Masson染色观察各组大鼠肺组织的病理形态学改变,用医学图像分析软件测定气道壁面积（Wat）、气道平滑肌面积（Wam）及两者占气道总面积的百分比。（2）比较各组Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白以及TGF-β1/Smad信号通路各指标变化:对大鼠右肺进行肺泡灌洗,ELISA法检测各组灌洗液中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad6、Smad7含量;取大鼠部分左肺组织,以免疫组化法测定TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad6、Smad7、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的平均光密度值;取大鼠右肺上叶、中叶,分别行Western Blotting和RT-qPCR检测,比较各组大鼠肺组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad6、Smad7、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白及mRNA相对表达水平。研究结果:（1）与正常组比较,哮喘组大鼠经卵蛋白激发后可观察到呼吸急促、搔抓口鼻、烦躁不安、腹肌抽搐、时有喷嚏等表现,并逐渐俯伏在一处,反应迟钝,可闻及明显的喘鸣音,地塞米松组同样具有以上表现,但体重明显减轻,毛发色泽更显暗淡,烦躁不安、暴躁程度更为明显,并具有较强攻击性,中药组以上症状均有所改善,喘鸣音减轻;哮喘组肺通气功能指标FVC、FEV0.2、FEV0.2/FVC%、PEF、FEF25-75%均较正常组显着下降（P<0.05）,出现了持续性的气流阻塞,地塞米松组相比哮喘组无明显差异（P>0.05）,中药组各项指标较二组均有明显改善（P<0.05）,气流阻塞症状有所缓解;HE染色及Masson染色结果显示哮喘组气道周围可见大量炎症细胞浸润,气道管腔明显变窄,气道壁、平滑肌层和基底膜层厚度显着增加,间质纤维增生,胶原蛋白沉积增多,Wat%、Wam%较正常组均显着升高（P<0.05）,气道重塑明显,地塞米松组相比哮喘组气道改变有所减轻、Wat%显着降低（P<0.05）,中药组气道改变较二组均有减轻,气道周围少量炎症细胞浸润,气道壁、平滑肌层和基底膜层厚度降低,胶原蛋白沉积减少,Wat%显着降低（P<0.05）;（2）与正常组比较,哮喘组大鼠肺泡灌洗液中TGF-β1、Smad2、Smad3含量均显着升高（P<0.05）,Smad6、Smad7含量均显着降低（P<0.05）,肺组织中 TGF-β1、Smad2、Smad3、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白及 mRNA 相对表达水平均显着升高（P<0.05）,Smad6、Smad7蛋白及mRNA相对表达水平均显着降低（P<0.05）;与哮喘组比较,地塞米松组大鼠肺泡灌洗液中TGF-β1含量显着降低（P<0.05）,肺组织中 TGF-β1、Smad2、Smad3、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白及 mRNA 相对表达水平均显着降低（P<0.05）,Smad6、Smad7蛋白及mRNA相对表达水平均显着升高（P<0.05）;与地塞米松组比较,中药组肺泡灌洗液中TGF-β1、Smad2、Smad3含量均显着降低（P<0.05）,Smad6、Smad7含量均显着升高（P<0.05）,肺组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白及mRNA相对表达水平均显着降低（P<0.05）,Smad6、Smad7蛋白及mRNA相对表达水平均显着升高（P<0.05）。研究结论:加减乌梅丸颗粒通过调控TGF-β1/Smad信号通路,可恢复Smad2/3和Smad6/7的平衡,抑制TGF-β1信号在细胞内的转导,进而减少气道平滑肌增生以及Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白沉积,抑制气道壁增厚,延缓气道重塑的发展,改善肺通气功能。
贺前松[6]（2019）在《从哮喘气道平滑肌增厚探讨“防风—乌梅”配伍的机制》文中提出目的本课题围绕哮喘过程中ASMC的病理变化,根据“驱邪利肺”、“标本兼治”等中医治法理论,以名医经验方“过敏煎”中君臣配伍“防风-乌梅”药对作为干预手段,结合该领域研究进展,对干预前后ASMC相关指标进行对比,探索辛散酸收配伍抑制气道平滑肌增厚的作用机制,揭示“过敏煎”配伍的科学内涵,以探索哮喘更有效、更具有针对性的中医药临床治疗方案。方法第一部分:“防风-乌梅”配伍对哮喘模型小鼠ASMC病理变化的影响及其机制研究。1、造模:将70只BALB/C小鼠随机分为正常对照组、哮喘模型组、激素干预组、防风组、乌梅组“防风-乌梅”组、“防风-乌梅”合激素干预组,每组10只。以复合型OVA建立哮喘模型,模型建立后,取小鼠肺组织进行相应处理,分别采用光学显微镜和透视电镜观察肺组织病理变化。2、“防风-乌梅”配伍对哮喘模型小鼠肺组织结构的影响:按上述方法造模成功后连续按组别用药干预7天。防风组、乌梅组、“防风-乌梅”组、“防风-乌梅”合激素干预组分别于上午9时给予防风、乌梅、“防风-乌梅”、“防风-乌梅”药液灌胃,其余各组给予生理盐水灌胃;激素干预组、“防风-乌梅”合激素干预组同时分别于下午3时给予0.02%布地奈德雾化吸入,其余各组给予生理盐水雾化吸入。取材后,进行相应处理,光学显微镜下观察“防风-乌梅”配伍对哮喘模型小鼠肺组织病理学的影响以及小鼠支气管平滑肌厚度的影响;透视电镜下观察“防风-乌梅”配伍对哮喘模型小鼠肺组织超微结构的影响。3、“防风-乌梅”配伍对哮喘模型小鼠肺组织气道重塑相关因子的影响:小鼠肺组织取材后匀浆,取上清液保存,采用ELISA法测定肺组织MMP-9、TIMP-1及炎症因子IL-6、IL-8、VEGF、TGF-β1、TNF-α的含量。4、“防风-乌梅”配伍对哮喘模型小鼠肺组织ASMC周期及表型转化的影响:小鼠肺组织取材进行相应处理后,采用免疫组织化学染色方法,观察细胞周期调控蛋白（细胞周期蛋白CyclinD1与细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子P27kip1）,凋亡蛋白（bcl-2、caspase-3）表达和分布;采用实时荧光定量PCR、Western-blot法检测平滑肌中细胞周期调控蛋白（CyclinD1、P27kip1）凋亡蛋白（bcl-2、caspase-3）mRNA、蛋白表达;分别采用实时荧光定量PCR、Western-blot法检测ASMC收缩型标志蛋白α-actin、合成型标志蛋白OPN在平滑肌中含量,判定表型转化情况。第二部分:“防风-乌梅”含药血清对PDGF诱导HBSMC增殖模型的影响及其机制研究。1、“防风-乌梅”配伍含药血清对HBSMC迁徙的影响:通过PDGF诱导的方式诱导HBSMC增殖模型;分别予大鼠灌胃防风、乌梅、“防风-乌梅”及生理盐水,制备含药血清;HBSMC增殖模型建立好后,取4代对数生长期的HBSMC,将其分为空白对照组、细胞模型组、正常大鼠血清组、正常大鼠血清细胞模型组、激素干预组、防风血清组、乌梅血清组、“防风-乌梅”血清组、“防风-乌梅”血清和激素干预组对细胞给予相应处理;采用平板迁移实验和跨膜迁移实验观察HBSMC的迁移能力。2、“防风-乌梅”配伍含药血清对HBSMC相关细胞因子的影响:ELISA法检测TNF-α、IL-8、MMP-9、TIMP-1的浓度及MMP-9/TIMP-1比值。结果第一部分:“防风-乌梅”配伍对哮喘模型小鼠ASMC病理变化的影响及其机制研究。1、造模:正常对照组肺组织结构未见异常;哮喘模型组支气管上皮结构被破坏,气道内见大量脱落上皮细胞,杯状细胞增生明显,粘膜下及气道周围炎性细胞（淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及巨噬细胞）浸润,气道壁及支气管平滑肌明显增厚;哮喘模型组肺泡II型上皮细胞线粒体结构不清晰,见明显肿胀,板层小体结构紊乱、线粒体空泡化严重,可见嗜酸性粒细胞颗粒。2、“防风-乌梅”配伍对哮喘模型小鼠肺组织结构的影响:与模型组相比,各药物组上皮结构均有改善,气道内可见少许脱落的上皮细胞,杯状细胞增生减轻,粘膜下及气道周围炎性细胞浸润缓解,气道壁及支气管平滑肌增厚减轻,以“防风-乌梅”组和“防风-乌梅”合激素干预组改善最明显;透视电镜下,药物治疗后哮喘模型组肺泡II型上皮细胞线粒体结构不清晰、肿胀、板层小体结构紊乱、严重线粒体空泡化等情况均得到明显改善,且“防风-乌梅”联合用药优于单独使用防风和乌梅,同时“防风-乌梅”合激素干预组有巨噬细胞出现,表明受损肺脏出现明显的修复迹象。3、“防风-乌梅”配伍对哮喘模型小鼠肺组织气道重塑相关因子的影响:“防风-乌梅”配伍可降低肺组织IL-6、IL-8、MMP-9、TIMP-1的表达及MMP-9/TIMP-1的比值（P<0.05或P<0.01）,以“防风-乌梅”合激素干预组最佳,“防风-乌梅”组优于防风组和乌梅组。相关性分析提示IL-6、IL-8与MMP-9、TIMP-1显着相关。4、“防风-乌梅”配伍对哮喘模型小鼠肺组织ASMC周期及表型转化的影响:综合各检测方法,结果显示“防风-乌梅”配伍可降低CyclinD1、bcl-2 mRNA及蛋白表达（P<0.05）,升高P27kip1、caspase-3 mRNA及蛋白表达（P<0.05）;“防风-乌梅”配伍能降低α-actin、OPN表达。第二部分:“防风-乌梅”含药血清对PDGF诱导人支气管平滑肌细胞HBSMC增殖模型的影响及其机制研究。1、“防风-乌梅”配伍含药血清对HBSMC迁徙的影响:平板迁移实验和跨膜迁移结果表明,“防风-乌梅”血清合激素干预组降低细胞迁移的能力要优于其余各给药组,“防风-乌梅”血清组降低HBSMC的迁移能力优于单独的防风血清组和乌梅血清组。2、“防风-乌梅”配伍含药血清对HBSMC增殖相关细胞因子的影响:ELISA法结果显示:“防风-乌梅”血清合激素干预组降低TNF-α、IL-8表达,抑制MMP-9/TIMP-1比值的能力要优于其余各给药组,“防风-乌梅”血清组降低TNF-α、IL-8表达,抑制MMP-9/TIMP-1比值的能力要优于单独使用防风血清组和乌梅血清组。结论1、“防风-乌梅”“相制为用”配伍可改善哮喘气道重塑,其机制可能与减轻支气管平滑肌肥厚、改善气道炎症、降低肺组织MMP-9、TIMP-1的表达及MMP-9/TIMP-1的比值,降低CyclinD1、bcl-2 mRNA及蛋白表达,升高P27kip1、Caspase-3 mRNA及蛋白表达,从而调节细胞增殖/凋亡失衡有关。2、“防风-乌梅”配伍能显着抑制HBSMC迁移与表型转换,阻滞细胞周期进程,影响气道重塑,其机制可能通过抑制TNF-α、IL-8释放,抑制MMP-9/TIMP-1比值有关。“防风-乌梅”作为“过敏煎”的君臣药对,其通过对哮喘发作过程中的ASMC增殖/凋亡平衡进行干预,减轻气道炎症,从而减缓气道平滑肌增厚,发挥其“相制为用”的作用。
李双[7]（2017）在《针刺对支气管哮喘大鼠肺组织CollagenⅠ、Fibronection、VEGF表达的影响》文中研究表明目的通过观察针刺对支气管哮喘大鼠肺组织Col I、FN、VEGF表达的影响,以期明确Col I、FN、VEGF与哮喘的关系以及针刺对其的调控作用。方法将90只大鼠按照随机数字表法分成3组,每组30只,分别为空白组、模型组、针刺组。采用腹腔注射OVA和Al（OH）3混合液致敏后雾化吸入OVA溶液激发法制备哮喘模型。空白组雾化吸入生理盐水,针刺组于针刺后雾化吸入OVA溶液。根据总干预时间的差异,分别于雾化2、4周后,按照随机数字表法从每组大鼠中选出10只处死,于雾化6周后处死剩余大鼠。空白组雾化2、4、6周大鼠分别记为A、B、C,模型组雾化2、4、6周大鼠分别记为D、E、F,针刺组针刺2、4、6周大鼠分别记为G、H、I。通过HE染色、Masson染色观察各组大鼠肺组织的病理改变情况,通过免疫组化法、ELISA法观察各组大鼠肺组织Col I、FN、VEGF的表达情况。结果1模型组大鼠在接受激动剂雾化激发时,出现烦躁不安、呼吸加快加深、口唇紫绀、二便失禁等症状,针刺组和空白组大鼠在雾化时上述症状较轻。2各组大鼠肺组织HE染色显示,模型组大鼠肺组织出现严重的气道重塑及气道炎症病理改变,且随着雾化周期的增加D、E、F组肺组织病理改变程度增加。针刺组及空白组大鼠肺组织无明显病理改变,且随着雾化周期的增加肺组织结构无明显变化。3各组大鼠肺组织Masson染色显示,模型组大鼠肺组织WA/Pi、WAm/Pi、WAc/Pi、WAi/Pi平均值均较空白组增大（P<0.05）,随着雾化周期的增长,D、E、F组WA/Pi、WAm/Pi、WAi/Pi的均值呈增长趋势,WAc/Pi无随雾化周期增长而增厚的现象。针刺组与空白组大鼠肺组织WA/Pi、WAm/Pi、WAc/Pi、WAi/Pi平均值无显着差异（P>0.05）。4各组大鼠肺组织免疫组化法、ELISA法检测显示,模型组大鼠肺组织Col I、FN、VEGF的阳性表达明显高于空白组（P<0.05）,且随着雾化周期的延长D、E、F各组Col I、FN、VEGF的表达呈下降趋势,但仍较空白组高（P<0.05）,差异有统计学意义。针刺组大鼠肺组织Col I、FN、VEGF的表达低于模型组（P<0.05）,差异有统计学意义。结论1针刺可以显着改善卵蛋白雾化激发引起的哮喘大鼠呼吸困难、口唇青紫、烦躁不安等症状。2随着雾化激发周期的增加,模型组D、E、F小组大鼠肺组织气道重塑程度逐渐加重,而针刺可以明显抑制哮喘大鼠气道重塑的发生发展。3哮喘模型大鼠肺组织Col I、FN、VEGF的表达增多,且随着雾化激发次数的增多哮喘大鼠肺组织Col I、FN、VEGF的表达水平呈下降趋势。4针刺可以抑制哮喘大鼠肺组织Col I、FN、VEGF的表达。
龙皎月[8]（2012）在《哮喘易感基因ADAM33对气道平滑肌细胞力学行为的影响》文中指出哮喘病是一种常见的呼吸道慢性炎症疾病，是指支气管在高反应状态下，由变应原或其他因素引起的气道狭窄的疾病，主要症状有胸闷、咳嗽、呼吸困难等。气道平滑肌细胞﹙Airway Smooth Muscle Cell，ASMC﹚是呼吸道的主要组成部分之一，具有重要的生理作用。当气道平滑肌在受到外来因子的刺激时会发生气道过度收缩反应（Airway hyperrespinsiveness，AHR），临床表现为患者气道过度缩窄和发作性呼吸障碍，这是导致哮喘病成为高危疾病的最终原因所在。虽然在哮喘病的研究当中，对ASMC收缩特性的认识已经有一个多世纪，但是关于气道平滑肌病理变化的机制却没有研究透彻。气道平滑肌是控制气管管径的效应器，其病理性收缩成为气道阻塞和呼吸困难的最终因素，它在决定哮喘病治疗方法的有效性方面起到关键的作用，普遍认为其病理性收缩是哮喘难治的重要的病理基础。去整合素碱金属蛋白酶33（A disintegrin and metalloprotease33，ADAM33）基因已被证实是一个哮喘易感基因，且在大部分哮喘患者的气道平滑肌和基底膜上其表达水平较健康受试者要高，说明ADAM33可能参与ASMC力学环境的调控，进而与哮喘病人ASMC力学特性异常及气道重构有关。然而，至今还没有直接的证据证明ASMC生物力学行为与其ADAM33表达之间的关系。因此，本文采用分子生物学方法调控ASMC的ADAM33表达，同时采用细胞生物力学方法测量超表达和沉默ADAM33的ASMC的力学行为，以揭示二者之间的直接关系。本文的主要研究内容和研究结果如下：①ADAM33的表达水平随着SD大鼠雾化周数的增加而显着性升高。首先，利用氢氧化铝作为佐剂，卵清蛋白（OVA）致敏并激发哮喘，建立SD（SpragueDawley）大鼠哮喘模型。每周隔天OVA雾化3次，每次30分钟，共雾化12周，每2周取大鼠肺组织。通过对肺功能（Penh）的测定及气道组织HE（Hematoxylin-Eosin staining）染色观察结果表明我们已成功构建大鼠哮喘模型。接着，利用定量RT-PCR和Western blot技术检测ADAM33在OVA雾化不同周数的SD大鼠哮喘平滑肌细胞中的表达，结果显示ADAM33的表达水平随着OVA雾化周数的增加而显着性升高，且定量RT-PCR与Western blot的实验结果基本一致。从而说明ADAM33的表达水平与哮喘的严重程度呈正相关，该结果与Lee等在哮喘病人中的研究发现相符合，更近一步证明我们实验中所构建的SD大鼠哮喘模型能真实地模拟哮喘病。②获得ADAM33超表达和沉默的ASMC。首先，构建ADAM33基因超表达和干扰慢病毒重组载体，然后进行慢病毒转染，以GFP空载及未转染细胞作为对照。在荧光显微镜下观察到重组慢病毒转染正常SD大鼠ASMC，24h后GFP表达逐渐增强，至培养72h时GFP表达最强到高峰，并发现当MOI（Multiplicity ofInfection）=100时，慢病毒感染ASMC的效率为95%。定量RT-PCR检测结果显示，超表达组ADAM33基因表达水平是正常对照组的8倍（P＜0.01），沉默组中pLVT453沉默效率最高达到75%（P＜0.01）；同时，Western blot测定各组细胞的ADAM33蛋白表达水平结果表明，超表达组细胞内ADAM33蛋白表达较两组对照明显增高（P＜0.01），而沉默组表达明显降低（P＜0.01），ADAM33蛋白在两组对照组中的表达量无明显差别。本实验成功获得了稳定的ADAM33超表达和沉默ASMC，且重组慢病毒转染明显上调或抑制了ASMC中ADAM33基因mRNA和蛋白的表达。③ADAM33基因表达水平的变化改变了ASMC的迁移能力和增殖能力。采用MTT法观察不同4组细胞增殖情况，发现超表达组pLV-ADAM33的细胞增殖能力与空白对照组相比没有显着性差异；而沉默组pMa-ADAM33相对于对空白照组细胞增殖能力明显降低（P＜0.05）。GFP对照组的细胞增殖能力显着低于未转染对照组（P＜0.01），由此我们可以看出慢病毒转染对细胞增殖能力有抑制作用，虽然上调ADAM33对细胞增殖能力对于未转染对照组来说无差异，但是相对GFP对照组的细胞增殖能力显着增强（P＜0.01）。划痕法（Wound healing）检测细胞横向迁移能力的结果显示，在12h时，4组细胞迁移无明显差异。但是在24h时，超表达组pLV-ADAM33的横向迁移能力与两组对照相比明显增强（P＜0.01）（P＜0.05）；而沉默组pMa-ADAM33的细胞显着降低（P＜0.01），该结果表明通过特异性改变ADAM33基因的表达，能够影响ASMC横向迁移能力。④ADAM33基因能调控ASMC的细胞基础刚度、收缩力及牵张力等细胞力学特性。运用光学捕捉（Optical trapping）与磁力扭转细胞测量术（Magnetic TwistingCytometry）和傅里叶变换牵引力显微术（Fourier Transform Traction Microscopy，FTTM）检测由慢病毒转染所获得的稳定超表达和干扰ADAM33的ASMC的生物力学特性。研究结果显示：1)超表达ADAM33的ASMC组pLV-ADAM33的细胞基础刚度、KCL激动剂处理后的收缩力、牵张力显着高于对照组，而ADAM33沉默的细胞组其上述参数明显低于对照。2)共聚焦免疫荧光结果显示ADAM33和黏着斑蛋白vinculin存在共定位关系，并且还有部分ADAM33有沿着应力纤维分布的情况，说明ADAM33可能调控细胞骨架结构和粘着斑的形成。3)通过定量RT-PCR检测结果发现，ADMA33基因表达水平的改变能调控细胞力学相关基因Calponin和Integrin-β1的表达。从以上实验结果，我们推测：调控ADAM33的表达直接影响到ASMCs的生物力学行为，提示ASMCs的生物力学行为与其ADAM33的表达存在直接的联系。因此，哮喘患者中ADAM33基因表达及修复的异常有可能在气道重塑和气道收缩高反应性等方面扮演决定性的角色，这对于深入理解哮喘的发病机制，特别是气道功能变换的内在调控机制，从而探寻有效的哮喘治疗靶点和药物具有深远的意义。
惠毅[9]（2012）在《基于肺病模型大鼠病理形态学及相关调控物质变化探讨“肺病及肠”病理传变规律及其机制》文中认为目的：本实验通过建立“肺病”（慢性支气管炎）动物模型,选取三个不同的时间点,观察造模后肺与大肠在病理形态学、细胞组织学、炎症介质等方面的对应性变化,探寻“肺病及肠”的传变规律及其病理传变机制。方法：选取SD大鼠,雄性,共60只。按体重随机分成空白对照（24只）和模型组（36只）。空白组大鼠置于无烟环境中饲养,模型组大鼠采用单纯烟熏法造模,每次烟熏50min,每天3次（分别在早上9点、下午2点和6点）,共烟熏70d。于首次造模第20天、50天、70天随机抽取空白组（8只）和模型组（12只）大鼠检测大鼠肺、胃肠功能；光镜观察肺、胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠、直肠组织病理形态学变化；电镜观察肺和结肠组织病理形态学改变；ELISA法检测大鼠肺、结肠组织TNF-α、IL-1β、ET-1、PGE2含量；免疫组化法检测肺、结肠组织VIP、SP、CGRP、iNOS表达。结果：1.病理生理肺功能：与空白组比较,模型组大鼠造模第20天、第50天、第70天呼吸频率增快,潮气量、每分钟通气量降低,有差异（P<0.05）或显着性差异（P<0.01）；与造模第20天比较,模型组大鼠造模第50天、第70天潮气量、每分钟通气量均降低,有显着性差异（P<0.01）。胃肠功能：与空白组比较,模型组大鼠造模第50天、第70天粪便含水率降低,有显着性差异（P<0.01）；第20天、第50天、第70天胃内残留率升高、小肠推进率降低,有显着性差异（P<0.01）；与造模第20天比较,模型组大鼠造模第50天、第70天粪便含水率降低、胃内残留率升高、小肠推进率均降低,有差异（P<0.05）或显着性差异（P<0.01）；与造模第50天比较,模型组大鼠造模第70天粪便含水率降低、胃内残留率升高、小肠推进率降低,有差异（P<0.05）或显着性差异（P<0.01）。2.病理形态学光镜：模型组大鼠造模第20天、第50天、第70天十二指肠、空肠、回肠、直肠、胃组织无明显变化；模型组大鼠肺组织于造模第20天、第50天、第70天均可见支气管广泛上皮细胞变性、坏死,不同程度炎细胞浸润：模型组大鼠结肠组织于造模第20天、第50天、第70天分别有40%、70%、80%大鼠结肠组织出现局部充血水肿,灶性上皮细胞变性、坏死,不同程度的慢性炎细胞浸润,严重者可见小灶性糜烂,黏膜上皮欠完整,腺体排列欠规则,黏膜及黏膜下炎细胞浸润；电镜：模型组大鼠造模第20天肺组织Ⅰ型肺泡上皮细胞肿胀,线粒体轻度肿胀,Ⅱ型肺泡上皮细胞增生；大鼠结肠组织超微结构病无明显改变。第50天、第70天肺组织Ⅰ型肺泡上皮细胞肿胀,线粒体重度肿胀,Ⅱ型肺泡上皮细胞增生,肺间质内胶原纤维增多、纤维母细胞活跃：大鼠结肠组织出现结肠黏膜上皮表面的微绒毛排列稀疏紊乱,线粒体肿胀,嵴排列紊乱,结肠组织黏膜下固有层间隙胶原纤维增生,见成纤维母细胞。3.相关调控物质TNF-α、IL-1β、ET-1、PGE2含量变化：与空白组比较,模型组大鼠造模第20天、第50天、第70天肺组织、结肠组织TNF-α、IL-1β、ET-1、PGE2含量明显升高,有差异（P<0.05）或显着性差异（P<0.01）；与造模第20天比较,模型组大鼠造模第50天、第70天肺组织、结肠组织TNF-α、IL-1β、ET-1、PGE2含量明显升高,有显着性差异（P<0.01）；与造模第50天比较,模型组大鼠造模第70天肺组织、结肠组织TNF-α、IL-1β、ET-1、PGE2含量明显升高,有显着性差异（P<0.01）。VIP、SP、CGRP、iNOS表达变化：与空白组比较,模型组大鼠造模第20天、第50天、第70天肺组织VIP、SP、CGRP、iNOS表达均升高（P<0.05或P<0.01）,第20天结肠组织VIP表达降低,CGRP、iNOS表达升高（P<0.05或P<0.01）,造模第50天、第70天肺组织、结肠组织VIP、SP表达降低,CGRP、iNOS表达升高（P<0.05或P<0.01）；与造模第20天比较,模型组大鼠造模第50天、第70天肺组织VIP、SP、iNOS表达升高（P<0.05或P<0.01）,模型组大鼠造模第50天结肠组织iNOS表达升高（P<0.01）,第70天结肠组织VIP、SP、CGRP、iNOS表达升高（P<0.05或P<0.01）；与造模第50天比较,模型组大鼠造模第70天肺组织VIP、CGRP、iNOS表达升高（P<0.05）,结肠组织SP、CGRP、iNOS表达升高（P<O.05或P<0.01）。结论：1.肺病大鼠可出现胃肠功能的改变,提示肺病可能传变到“肠”。2.肺病大鼠可出现大肠的病理变化,提示肺病可能传变到“肠”；肺病大鼠十二指肠、空肠、回肠、直肠、胃组织无明显病理改变,而结肠组织出现不同程度的病理改变,提示肺病传变到“肠”的主要部位可能在结肠。3.肺病大鼠可出现大肠相关调控物质的变化,提示肺病可能传变到“肠”。4.初步发现TNF-α、IL-1、ET-1、PGE2等炎症介质可能是“肺病及肠”的物质基础。5.初步发现VIP、SP、CGRP、iNOS等神经肽物质可能是“肺病及肠”的物质基础。6.模型大鼠肺病传变到“肠”的时间节点在造模50天左右,肺病是否能传变到“肠”,主要取决于肺脏病变的病理损伤程度,而不单纯取决于造模时间的长短。
张玉芳[10]（2010）在《加减射干麻黄汤对哮喘急性发作期临床证候的影响和机制探讨》文中指出目的：根据辨病施治的原理,从临床研究和实验研究两方面观察加减射干麻黄汤对支气管哮喘的疗效,探讨其对哮喘气道重塑的影响,从而为防治哮喘气道重塑提供新方法。方法：1、临床研究：将60例符合条件的患者随机分为治疗组和对照组。治疗组用加减射干麻黄汤加常规西医治疗,对照组用常规西医治疗,疗程7天,观察两组中医证候的变化。2、实验研究：将SPF级SD大鼠随机分为哮喘组和正常对照组,采用腹腔注射和雾化卵蛋白和氢氧化铝混合液的方法建立大鼠哮喘模型,结合血清药理学方法,体外培养哮喘气道平滑肌细胞（ASMC）,用MTT比色法测定ASMC的D值以了解细胞增殖情况。结果：1、临床研究：加减射干麻黄汤加常规西医治疗组在显控率上较对照组有显着性提高（P<0.05）。两组患者治疗后咳嗽、咯痰、喘息和哮鸣音的症状明显改善,与治疗前比较有显着性差异（P<0.05）。两组积分差对比,治疗组治疗前后咳嗽、咯痰、喘息和哮鸣音的改善更明显,与对照组有显着性差异（P<0.05）。2、实验研究：（1）细胞生长情况：倒置显微镜下观察单个平滑肌细胞呈梭形,有较长细胞突起,核圆形居中,有1-2个核仁,3d左右细胞贴壁生长,7d左右贴壁细胞完全伸展,细胞伸出较长的突起并相互接触,14d左右细胞铺满瓶底,细胞生长致密时平行排列成束,部分重叠,表现为典型的“峰和谷”生长状态。传代细胞-般12-24h贴壁,6d左右融合90%,可继续传代。α-action免疫荧光法鉴定培养的细胞为平滑肌细胞。（2）不同组别ASMC的光密度（D值）：哮喘大鼠空白组ASMC的D值较正常大鼠组的有显着增高（P<0.05）。正常大鼠PMA组ASMC的D值较空白组的显着增高（P<0.05）,Ro-31-8220组、射干麻黄液高中剂量组的D值及空白组的相互间无显着差异（P>0.05）。哮喘模型大鼠PMA组ASMC的D值较空白组的显着增加（P<0.05）,Ro-31-8220组的D值较空白组的显着降低（P<0.05）,加减射干麻黄汤高中低剂量组的D值较空白组的显着降低（P<0.05）,加减射干麻黄汤高中低剂量组的D值和Ro-31-8220组的无显着差异（P>0.05）结论：加减射干麻黄汤通过抑制支气管平滑肌细胞增殖改善气道的重塑,减轻气道高反应性,进而改善哮喘发作时的症状。
二、UROTENSIN II RECEPTOR IN THE RAT AIRWAY SMOOTH MUSCLE AND ITS EFFECT ON THE RAT AIRWAY SMOOTH MUSCLE CELLS PROLIFERATION（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、UROTENSIN II RECEPTOR IN THE RAT AIRWAY SMOOTH MUSCLE AND ITS EFFECT ON THE RAT AIRWAY SMOOTH MUSCLE CELLS PROLIFERATION（论文提纲范文）
（1）TGF-β1-TAK1-AMPKα激活PINK1-Parkin通路介导线粒体自噬调控气道平滑肌细胞增殖及对哮喘气道重构的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 TGF-β1-TAK1-AMPKα激活PINK1-Parkin通路介导线粒体自噬调控气道平滑肌细胞增殖 |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 TGF-β1 对气道平滑肌细胞线粒体自噬的影响 |
| 3.2 TGF-β1 介导线粒体自噬对气道平滑肌细胞的影响 |
| 3.3 TGF-β1 通过TAK1/AMPKα/PINK1 通路激活线粒体自噬途径 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 小结 |
| 第二部分 TGF-β1 介导线粒体自噬在哮喘气道重构中的作用及机制研究 |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 哮喘气道重构模型小鼠中TGF-β1 通过TAK1-AMPKα通路调控PINK1/Parkin介导线粒体自噬 |
| 3.2 哮喘气道重构模型小鼠中TGF-β1-TAK1-AMPKα通路调控PINK1/Parkin介导线粒体自噬参与气道重构 |
| 3.3 阻断TGF-β1 介导的线粒体自噬对PCNA、α-SMA、MMP9 表达的影响 |
| 3.4 阻断TGF-β1 介导的线粒体自噬对气道高反应性的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 综述 TGF-β1、自噬与哮喘气道重构 |
| 参考文献 |
（2）马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱的合成及其抗哮喘和抗炎活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 四氢异喹啉类生物碱的生物活性研究进展 |
| 1.1.1 抗肿瘤活性 |
| 1.1.2 抗病原微生物活性 |
| 1.1.3 抗炎作用 |
| 1.1.4 激动β_2肾上腺素受体和扩张支气管作用 |
| 1.1.5 中枢神经系统作用 |
| 1.1.6 治疗糖尿病 |
| 1.2 本课题立题依据与研究内容 |
| 1.2.1 哮喘等气道慢性炎症性疾病是危害人类健康的常见病和多发病 |
| 1.2.2 扩张支气管和抗炎是治疗哮喘等气道慢性炎症性疾病的两大策略 |
| 1.2.3 肾上腺素受体概况及β_2-AR激动剂扩张支气管的作用机制 |
| 1.2.4 马齿苋具有治疗哮喘等呼吸系统炎症疾病的应用基础,其激动β2-AR抗哮喘活性成分有待深入研究 |
| 参考文献 |
| 第二章 马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱及其衍生物的合成及纯化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验试剂 |
| 2.4 实验步骤 |
| 2.4.1 儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱(1-14)的合成 |
| 2.4.2 儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱(1-14)的分离纯化 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱(1-14)的合成 |
| 2.5.2 化合物结构鉴定 |
| 2.5.3 AB-8大孔吸附树脂柱色谱法制备儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱的洗脱工艺研究 |
| 2.6 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱抗哮喘活性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱及其衍生物对肾上腺素受体的活性筛选及其构效关系研究 |
| 3.2.1 实验原理 |
| 3.2.2 实验步骤 |
| 3.2.3 实验结果 |
| 3.3 马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱12、2以及OE对组胺诱导豚鼠离体气管平滑肌收缩模型的影响 |
| 3.3.1 实验动物 |
| 3.3.2 仪器 |
| 3.3.3 试剂 |
| 3.3.4 主要试剂的配制 |
| 3.3.5 实验步骤 |
| 3.3.6 实验结果 |
| 3.4 马齿苋提取液(WEAPS)以及儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱12、2、OE对组胺致豚鼠哮喘模型气道痉挛的影响 |
| 3.4.1 实验步骤 |
| 3.4.2 数据处理 |
| 3.4.3 实验结果 |
| 3.5 儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱12对卵白蛋白诱导过敏性哮喘小鼠模型气道炎症的影响 |
| 3.5.1 实验动物 |
| 3.5.2 仪器 |
| 3.5.3 试剂 |
| 3.5.4 实验溶液配制 |
| 3.5.5 动物分组及给药 |
| 3.5.6 小鼠血液、支气管肺泡灌洗液的制备 |
| 3.5.7 小鼠BALF上清液TNF-α含量测定 |
| 3.5.8 小鼠BALF上清液IL-1β含量测定 |
| 3.5.9 小鼠BALF上清液IL-5含量测定 |
| 3.5.10 小鼠BALF上清液IL-13含量测定 |
| 3.5.11 数据处理 |
| 3.5.12 实验结果 |
| 3.6 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱12和2对脂多糖诱导脓毒症小鼠模型的抗炎活性研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 仪器 |
| 4.2.3 试剂 |
| 4.3 实验内容 |
| 4.3.1 试剂配制 |
| 4.3.2 动物分组及给药 |
| 4.3.3 小鼠血浆、支气管肺泡灌洗液的制备 |
| 4.3.4 小鼠血浆一氧化氮含量测定 |
| 4.3.5 小鼠血浆TNF-α含量测定 |
| 4.3.6 小鼠血浆IL-6含量测定 |
| 4.3.7 小鼠BALF上清液TNF-α含量测定 |
| 4.3.8 小鼠BALF上清液IL-6含量测定 |
| 4.4 数据处理 |
| 4.5 实验结果 |
| 4.5.1 儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱12对LPS诱导脓毒症小鼠的影响 |
| 4.5.2 儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱2对LPS诱导脓毒症小鼠的影响 |
| 4.6 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士研究生期间发表的论文 |
| 附录 |
| 附录1: 第二章附表 |
| 附录2: 第三章附表 |
| 附录3: 第四章附表 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）TRPV4在高肺血流性肺动脉高压肺血管重构中的作用及机制探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 TRPV4在高肺血流性肺动脉高压肺动脉平滑肌细胞中的表达及其对肺动脉平滑肌细胞增殖及迁移的影响 |
| 引言 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第二部分 TRPV4基因表达下调对高肺血流性肺动脉高压肺血管重构的影响 |
| 引言 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第三部分 TRPV4影响高肺血流性肺动脉高压肺血管重构的机制 |
| 引言 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 全文总结 |
| 综述 TRPV4与心血管疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（4）华山参滴丸对哮喘的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1哮喘的研究进展 |
| 1.1.1 哮喘病理学的研究 |
| 1.1.2 哮喘发病机制的研究进展 |
| 1.2 平喘药物的研究进展 |
| 1.2.1 西药 |
| 1.2.2 中药 |
| 1.3 华山参滴丸的研究进展 |
| 1.4 课题研究的目的及意义 |
| 1.5 本文研究的内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验药品 |
| 2.2 实验动物 |
| 2.3 实验试剂 |
| 2.4 实验仪器 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 HPLC-Q-TOF-MS物质基础分析 |
| 2.5.2 哮喘动物实验 |
| 2.5.3 离体气管实验 |
| 2.5.4 分子对接 |
| 2.5.5 统计学分析 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 华山参滴丸的物质基础研究 |
| 3.1.1 HPLC-Q-TOF-MS鉴别华山参滴丸的成分 |
| 3.1.2 HPLC-Q-TOF-MS分析华山参滴丸的活性成分 |
| 3.1.3 小结 |
| 3.2 华山参滴丸对哮喘小鼠的药效学研究 |
| 3.2.1 小鼠行为学观察 |
| 3.2.2 小鼠体重变化及肺指数 |
| 3.2.3 肺泡灌洗液中总蛋白的含量分析 |
| 3.2.4 肺组织病理学分析 |
| 3.2.5 小结 |
| 3.3 华山参滴丸的对哮喘的作用机制研究 |
| 3.3.1 华山参滴丸对气道炎症的作用机制研究 |
| 3.3.2 华山参滴丸对气道高反应的作用机制研究 |
| 3.3.3 小结 |
| 3.4 讨论 |
| 4 结论 |
| 4.1. 全文总结 |
| 4.2. 论文的创新点 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 8 致谢 |
（5）加减乌梅丸颗粒对哮喘大鼠激素干预模型气道重塑及TGF-β1/Smad通路的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 激素依赖型哮喘的发病机制与治疗进展 |
| 1 激素依赖型哮喘的定义 |
| 2 激素依赖型哮喘的发病机制 |
| 3 激素依赖型哮喘临床治疗进展 |
| 4 总结与展望 |
| 综述二 乌梅丸治疗支气管哮喘的研究进展 |
| 1 乌梅丸源流及其发展 |
| 2 乌梅丸治疗支气管哮喘的理论基础 |
| 3 乌梅丸治疗支气管哮喘的临床应用进展 |
| 4 乌梅丸治疗支气管哮喘的现代药理学研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 加减乌梅丸颗粒对哮喘大鼠激素干预模型气道重塑及肺通气功能的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 实验二 加减乌梅丸颗粒对哮喘大鼠激素干预模型TGF-β1/Smad信号通路及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（6）从哮喘气道平滑肌增厚探讨“防风—乌梅”配伍的机制（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 研究背景 |
| 2 中医药防治哮喘优势 |
| 3 假说提出及研究内容 |
| 第一部分 “防风-乌梅”配伍对哮喘模型小鼠ASMC病理变化的影响及其机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要药品、试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 模型建立(OVA+氢氧化铝法) |
| 2.3 分组及给药 |
| 2.4 取材 |
| 2.5 HE染色观察小鼠肺组织病理变化 |
| 2.6 扫描电子显微镜观察小鼠气道上皮细胞超微结构 |
| 2.7 ELISA检测MMP-9、TIMP-1、IL-6、IL-8、VEGF、TGF-β1、TNF-α含量 |
| 2.8 RT-PCR检测CyclinD1、P27kip1、bcl-2、caspase-3、α-actin、OPNmRNA |
| 2.9 Western-blot实验检测CyclinD1、P27kip1、bcl-2、caspase-3、α-actin、OPN蛋白表达量 |
| 2.10 免疫组化检测CyclinD1、P27kip1、bcl-2、caspase-3、α-actin、OPN蛋白表达量及分布 |
| 2.11 统计方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 “防风-乌梅”配伍对哮喘模型小鼠肺组织结构的影响 |
| 3.2 “防风-乌梅”配伍对哮喘模型小鼠肺组织气道重塑相关因子的影响 |
| 3.3 “防风-乌梅”配伍对哮喘模型小鼠细胞周期、凋亡相关基因的影响 |
| 3.4 “防风-乌梅”配伍对哮喘模型小鼠表型转化的影响 |
| 4 小结 |
| 第二部分 “防风-乌梅”含药血清对PDGF诱导人支气管平滑肌细胞HBSMC增殖模型的影响及其机制研究 |
| 1 实验动物及实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要药品、试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 含药血清制备 |
| 2.2 建立细胞模型 |
| 2.3 细胞分组及给药 |
| 2.4 平板迁移实验 |
| 2.5 跨膜迁移实验 |
| 2.6 ELISA法检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-8、MMP-9、TIMP-1 表达 |
| 2.7 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 “防风-乌梅”含药血清对HBSMC细胞平行迁移能力的影响 |
| 3.2 “防风-乌梅”含药血清对HBSMC TNF-α、IL-8、MMP-9、TIMP-1 表达及MMP-9/TIMP-1 的影响 |
| 4 小结 |
| 讨论 |
| 1 实验对象及造模方法选择 |
| 2 配伍药对“防风-乌梅”的确定 |
| 3 药液浓度及给药途径 |
| 4 中医药对气道平滑肌增厚的干预机制探讨 |
| 结论 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 中医药防治哮喘机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（7）针刺对支气管哮喘大鼠肺组织CollagenⅠ、Fibronection、VEGF表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第1章 实验研究 |
| 1.1 实验材料与方法 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要实验仪器 |
| 1.1.3 主要试验试剂及配制方法 |
| 1.1.4 实验动物分组及动物模型的建立 |
| 1.1.5 样本采集 |
| 1.1.6 HE及Masson染色观察各组大鼠肺组织形态学变化 |
| 1.1.7 免疫组化法检测各组大鼠肺组织Col I、FN、VEGF的表达 |
| 1.1.8 ELISA法检测各组大鼠肺组织Col I、FN、VEGF的表达 |
| 1.1.9 统计学方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 各组大鼠行为表现 |
| 1.2.2 各组大鼠肺组织形态学改变 |
| 1.2.3 免疫组化法结果各组大鼠肺组织Col I、FN、VEGF的表达情况 |
| 1.2.4 ELISA法结果各组大鼠肺组织Col I、FN、VEGF的表达情况 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 祖国医学对哮喘的认识 |
| 1.3.2 针刺对哮喘的治疗 |
| 1.3.3 针刺穴位的选取 |
| 1.3.4 支气管哮喘模型制备方法的选取 |
| 1.3.5 支气管哮喘大鼠肺组织病理改变 |
| 1.3.6 Col I、FN、VEGF在哮喘气道重塑中的作用 |
| 1.3.7 针刺对哮喘大鼠肺组织Col I、FN、VEGF表达的影响 |
| 1.3.8 不足与展望 |
| 1.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第2章 综述 |
| 2.1 气道重塑的主要病理改变 |
| 2.1.1 平滑肌细胞增殖及肥大 |
| 2.1.2 血管增生及重塑 |
| 2.1.3 上皮细胞缺失 |
| 2.1.4 杯状细胞增生及粘液分泌增加 |
| 2.1.5 上皮下纤维化及胶原沉积 |
| 2.2 针刺对于哮喘气道重塑的调节 |
| 2.2.1 针刺对气道重塑病理表现的影响 |
| 2.2.2 针刺影响气道重塑病理表现的机制 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 学位论文数据集 |
（8）哮喘易感基因ADAM33对气道平滑肌细胞力学行为的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词列表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 问题的提出与研究意义 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 气道高反应性在哮喘病中的研究 |
| 1.2.2 气道平滑肌细胞在哮喘病中扮演重要角色 |
| 1.2.3 气道平滑肌细胞力学行为测定 |
| 1.2.4 哮喘相关基因研究 |
| 1.2.5 ADAMs 与哮喘 |
| 1.2.6 ADAM33 对气道平滑肌细胞的影响 |
| 1.3 课题的研究目的及研究内容 |
| 1.3.1 课题的研究目的与意义 |
| 1.3.2 课题的研究内容 |
| 1.3.3 课题研究的技术路线 |
| 1.3.4 课题的创新点 |
| 2 ADAM33 在 SD 大鼠哮喘模型中的表达研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料、仪器与试剂 |
| 2.2.1 实验动物模型的来源 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 主要实验试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 OVA 刺激下的 SD 大鼠哮喘模型的制备 |
| 2.3.2 对 SD 大鼠哮喘模型的鉴定 |
| 2.3.3 SD 大鼠哮喘模型的气道平滑肌细胞的培养 |
| 2.3.4 提取 SD 大鼠哮喘模型气道平滑肌细胞总 RNA 及运用定量 RT-PCR 检测其ADAM33 mRNA 的表达水平 |
| 2.3.5 提取 SD 大鼠哮喘模型气道平滑肌细胞总蛋白及运用 Western blot 检测其ADAM33 蛋白的表达水平 |
| 2.4 数据处理与统计分析 |
| 2.5 结果与分析 |
| 2.5.1 对 SD 大鼠哮喘模型的测定结果 |
| 2.5.2 气道平滑肌细胞鉴定结果 |
| 2.5.3 ADAM33 基因及蛋白在 OVA 雾化不同周数的哮喘模型的气道平滑肌细胞中的表达模式 |
| 2.6 讨论 |
| 2.7 本章小结 |
| 3 慢病毒转染正常 SD 大鼠气道平滑肌细胞调控 ADAM33 基因表达31 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 主要实验材料与试剂 |
| 3.2.1 细胞来源及培养 |
| 3.2.2 主要实验试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 慢病毒技术 |
| 3.3.2 ADM33 超表达载体 pLVX-EGFP-3FLAG 的构建及鉴定 |
| 3.3.3 ADAM33 慢病毒 RNA 干扰载体 pMagic 4.1 的构建及鉴定 |
| 3.3.4 慢病毒的包装、浓缩和滴度测定 |
| 3.3.5 慢病毒转染气道平滑肌细胞 |
| 3.3.6 慢病毒实验注意事项 |
| 3.3.7 提取转染细胞的总 RNA 及总蛋白，定量 RT-PCR 和 Western blot 检测 ADAM33表达量 |
| 3.4 数据处理与统计分析 |
| 3.5 结果与分析 |
| 3.5.1 ADM33 的超表达载体 pLVX-EGFP-3FLAG 的构建及鉴定 |
| 3.5.2 ADM33 的干扰载体 pMagic 4.1 的构建及鉴定 |
| 3.5.3 重组慢病毒滴度的确定 |
| 3.5.4 重组慢病毒转染正常 SD 大鼠气道平滑肌细胞 |
| 3.5.5 重组慢病毒成功转染正常 SD 大鼠气道平滑肌细胞，并有效调控气道平滑肌细胞 ADAM33 基因的表达 |
| 3.6 讨论 |
| 3.7 本章小结 |
| 4 调控 ADAM33 基因的表达对气道平滑肌细胞生物学行为影响的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 MTT 法检测转染细胞的增殖能力 |
| 4.2.2 Transwell 小室法检测细胞的跨膜迁移能力 |
| 4.2.3 细胞划痕法检验细胞横向迁移能力 |
| 4.3 数据处理与统计分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 ADAM33 基因对细胞增殖能力的影响 |
| 4.4.2 ADAM33 基因调控对细胞迁移能力的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 5 调控 ADAM33 基因的表达对气道平滑肌细胞生物力学行为影响的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 运用磁微粒扭转细胞测量系统测定细胞的刚度和收缩力 |
| 5.2.2 运用傅里叶变换牵引力显微术（FTTM）测量细胞牵引力大小 |
| 5.2.3 共聚焦显微镜对转染细胞的 ADAM33 和 vinculin 蛋白的共定位免疫荧光染色观察 |
| 5.2.4 总 RNA 的提取，定量 RT-PCR 检测与力学相关基因的表达 |
| 5.3 数据处理与统计分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 ADM33 调控对细胞刚度和收缩力的影响 |
| 5.4.2 ADAM33 调控对细胞牵张力大小的影响 |
| 5.4.3 细胞的 ADM33 和 vinculin 蛋白的共定位免疫荧光染色结果 |
| 5.4.4 调控 ADAM33 对细胞生物力学相关基因表达的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 6 后续研究展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A. 作者在攻读学位期间发表的论文目录 |
| B. 作者在攻读学位期间参加科研项目情况 |
（9）基于肺病模型大鼠病理形态学及相关调控物质变化探讨“肺病及肠”病理传变规律及其机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词对照表 |
| 目录 |
| 前言 |
| 上篇 文献研究 |
| 第一部分 中医对“肺与大肠相表里”的理论认识 |
| 1 中医对肺与大肠的定位 |
| 1.1 从解剖形态学角度探讨肺与大肠的定位 |
| 1.2 从生理功能角度探讨肺与大肠定位 |
| 2 “肺与大肠相表里”的理论内涵 |
| 2.1 “肺”与“大肠”的经脉络属 |
| 2.2 肺与大肠生理功能的相互依存 |
| 2.3 肺与大肠相互影响的病理表现 |
| 3 “肺与大肠相表里”的病机概述 |
| 3.1 中医对“肺”与“大肠”相互传变病机的认识 |
| 3.2 中医对“肺”与“大肠”相互传变物质基础的认识 |
| 第二部分 现代医学对“肺与大肠相表里”的实验研究和临床研究评述 |
| 1 “肺与大肠相表里”实验研究进展 |
| 1.1 基于“肺与大肠相表里”理论建立动物模型的实验研究进展 |
| 1.2 “肺与大肠相表里”病理机制研究进展 |
| 2 “肺与大肠相表里”临床研究进展 |
| 2.1 肺病治肠 |
| 2.2 肠病治肺 |
| 2.3 肺肠同治 |
| 2.4 针灸治疗 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 下篇 实验研究 |
| 实验一 大鼠肺病(慢性支气管炎)模型的建立和评价 |
| 1 模型的建立 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 模型的评价 |
| 2.1 一般行为表现观察结果 |
| 2.2 肺功能、胃肠功能观察结果 |
| 2.3 肺、十二指肠、空肠、回肠、结肠、直肠、胃组织病理形态学观察结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 实验结果的讨论 |
| 3.2 “肺病及肠”动物模型建立的讨论 |
| 3.3 肺病传变到“肠”具体部位的探讨 |
| 实验二 从肺病模型大鼠肺、结肠组织TNF-α、IL-1β、ET-1、PGE2含量变化探讨“肺病及肠” 病理传变机制 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 药物与试剂 |
| 1.3 实验仪器与设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 大鼠慢性支气管炎模型的建立方法 |
| 2.2 大鼠肺、结肠组织TNF-α、IL-1 β、ET-1、PGE2含量检测方法 |
| 2.3 数据分析与统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 大鼠肺、结肠组织TNF-α含量结果 |
| 3.2 大鼠肺、结肠组织IL-1β含量结果 |
| 3.3 大鼠肺、结肠组织ET-1含量结果 |
| 3.4 大鼠肺、结肠组织PGE2含量结果 |
| 4 分析与讨论 |
| 4.1 肺病可向“肠”传变,出现大鼠结肠组织TNF-α、IL-1 β、ET-1、PGE2含量变化 |
| 4.2 肺病是否能传变到“肠”,主要取决于肺脏病变的病理损伤程度 |
| 4.3 炎性细胞因子可能是肺病传变到“肠”的物质基础 |
| 实验三 从肺病模型大鼠肺、结肠组织SP、VIP、CGRP、iNOS表达变化探讨“肺病及肠”病理传变机制 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 药物与试剂 |
| 1.3 实验仪器与设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 大鼠慢性支气管炎模型的建立方法 |
| 2.2 大鼠肺、结肠组织SP、VIP、CGRP、iNOS表达检测方法 |
| 2.3 数据分析与统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 大鼠肺、结肠组织VIP表达结果 |
| 3.2 大鼠肺、结肠组织SP表达结果 |
| 3.3 大鼠肺、结肠组织CGRP表达结果 |
| 3.4 大鼠肺、结肠组织iNOS表达结果 |
| 4 分析与讨论 |
| 4.1 肺病可向“肠”传变,出现大鼠结肠组织VIP、SP、CGRP、iNOS表达变化 |
| 4.2 肺病是否能传变到“肠”,主要取决于肺脏病变的病理损伤程度 |
| 4.3 神经肽物质可能是肺病传变到“肠”的物质基础 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 问题与展望 |
| 附图 |
| 综述 “肺病及肠”相关细胞因子及调控物质概述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（10）加减射干麻黄汤对哮喘急性发作期临床证候的影响和机制探讨（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 一、古代文献中关于支气管哮喘的记载 |
| 二、现代中医对于支气管哮喘的研究进展 |
| 三、中医药治疗支气管哮喘的优势 |
| 四、现代医学关于支气管哮喘气道重塑研究进展 |
| 第二部分 临床研究 |
| 一、临床资料 |
| (一) 病例来源 |
| (二) 诊断标准 |
| 二、研究方法 |
| 1、分组方法 |
| 2、给药方法 |
| 3、观察指标 |
| 4、统计分析 |
| 三、观察结果 |
| 1、一般情况分析 |
| 2、两组总疗效比较 |
| 3、两组主要症状、体征总积分比较 |
| 第三部分 实验研究 |
| 一、实验材料 |
| 1、药物 |
| 2、主要试剂与仪器 |
| 3、动物 |
| 二、实验方法 |
| 1、大鼠哮喘模型的建立及分组 |
| 2、药物血清制备 |
| 3、支气管平滑肌细胞的培养、传代、鉴定 |
| 4、支气管平滑肌细胞的分组和干预 |
| 5、MTT比色法检测支气管平滑肌细胞增殖 |
| 6、统计学处理 |
| 三、实验结果 |
| 1、细胞生长情况 |
| 2、支气管平滑肌细胞的光密度 |
| 第四部分 讨论 |
| 一、本研究组方特点及现代药理研究 |
| 1、本研究组方特点 |
| 2、单味药的现代药理研究 |
| 二、结果分析 |
| 1、临床结果分析 |
| 2、实验结果分析 |
| 结语 |
| 文献参考 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、UROTENSIN II RECEPTOR IN THE RAT AIRWAY SMOOTH MUSCLE AND ITS EFFECT ON THE RAT AIRWAY SMOOTH MUSCLE CELLS PROLIFERATION（论文参考文献）
- [1]TGF-β1-TAK1-AMPKα激活PINK1-Parkin通路介导线粒体自噬调控气道平滑肌细胞增殖及对哮喘气道重构的影响[D]. 朴艺花. 延边大学, 2021
- [2]马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱的合成及其抗哮喘和抗炎活性研究[D]. 杨二兰. 山东大学, 2020
- [3]TRPV4在高肺血流性肺动脉高压肺血管重构中的作用及机制探究[D]. 刘冬立. 广西医科大学, 2020
- [4]华山参滴丸对哮喘的作用机制研究[D]. 崔妮娜. 天津科技大学, 2020(08)
- [5]加减乌梅丸颗粒对哮喘大鼠激素干预模型气道重塑及TGF-β1/Smad通路的影响[D]. 陈秋仪. 北京中医药大学, 2020(04)
- [6]从哮喘气道平滑肌增厚探讨“防风—乌梅”配伍的机制[D]. 贺前松. 成都中医药大学, 2019(04)
- [7]针刺对支气管哮喘大鼠肺组织CollagenⅠ、Fibronection、VEGF表达的影响[D]. 李双. 华北理工大学, 2017(03)
- [8]哮喘易感基因ADAM33对气道平滑肌细胞力学行为的影响[D]. 龙皎月. 重庆大学, 2012(05)
- [9]基于肺病模型大鼠病理形态学及相关调控物质变化探讨“肺病及肠”病理传变规律及其机制[D]. 惠毅. 成都中医药大学, 2012(04)
- [10]加减射干麻黄汤对哮喘急性发作期临床证候的影响和机制探讨[D]. 张玉芳. 广州中医药大学, 2010(10)
标签：细胞增殖论文; 自噬论文; 哮喘的症状论文; 哮喘最佳治疗方法论文; 平滑肌论文;