一、Skp2和p27在人脑胶质瘤中的表达及其意义（论文文献综述）
陈晓文[1]（2021）在《Skp2对慢性髓细胞白血病细胞增殖及其对伊马替尼敏感调控机制的研究》文中进行了进一步梳理研究背景:慢性髓细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML）是临床常见的血液系统恶性肿瘤,主要特征为骨髓造血生成大量未成熟的白细胞,其发病率高达新发成人白血病的20%。BCR-ABL融合基因目前被认为是CML发病的重要原因和基本特征,该融合基因表达可生成具备组成性酪氨酸激酶活性的BCR-ABL嵌合蛋白。在CML的临床治疗中,特异性BCR-ABL抑制剂,如酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors,TKI）可将患者生存率显着提高,已被临床广泛应用。伊马替尼是（IM）一种通过阻断BCR-ABL蛋白的非活性构象的TKI,首次应用于CML的治疗,疗效显着,毒性较低。但仍有大量CML患者对伊马替尼不敏感或通过多种细胞机制产生耐药性。因此,在CML进展过程中筛选出有效的治疗靶点是非常迫切的,这将有助于提高CML在TKI药物治疗中的效果。S期激酶相关蛋白2（S-phase kinase associated protein 2,Skp2）是由人Skp2基因编码的E3泛素连接酶。Skp2是一种C-Myc直接靶基因,在细胞周期进程的调控中起重要作用,多种恶性肿瘤中常发现有其表达上调。在血清缺乏的细胞中,Skp2过表达从而诱导细胞周期素A积累和p27磷酸化依赖性的降解从而促进细胞进入S期。Skp2还参与其他细胞周期调节蛋白的泛素化,包括细胞周期蛋白E和转录因子E2F1。目前国内外多项研究证实Skp2与许多实体肿瘤的化疗耐药性有关。如Skp2通过p27-CDKs-E2F1途径正向调节有丝分裂阻滞缺陷蛋白2（mitotic arrest deficient 2,MAD2）的表达,通过抑制Skp2可以增强肺癌细胞对紫杉醇的敏感性。但Skp2在CML中的发生和抗肿瘤耐药中的作用尚待明确。研究目的:比较CML患者与正常对照组外周血白细胞中Skp2的蛋白水平与m RNA水平。探究Skp2的异常表达在K562细胞中的作用机制:在K562细胞中稳定敲减和过表达Skp2基因,检测细胞数量变化和细胞的增殖能力变化。在K562细胞中分别敲减和过表达c AMP应答元件结合蛋白（CREB）基因,检测Skp2的m RNA水平。检测抑制PI3K/Akt-CREB-Skp2轴后K562细胞对伊马替尼的敏感性变化。研究方法:1.收集24例新诊断的CML患者（研究组）和7例健康体检者（对照组）外周血,对外周血样本进行白细胞分离。分别通过实时荧光定量PCR（q RT-PCR）和蛋白质印迹法（Western Blot）分析两组样本中Skp2的m RNA水平和蛋白水平。2.人CML细胞系K562在37℃,5%的CO2条件下用的RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清）培养。构建基于PLK0.1的sh RNA-Skp2质粒,在K562细胞中稳定敲减Skp2,用Western Blot法检测稳定表达sh RNA-ctrl、sh RNA-skp2-1或sh RNA-skp2-2的K562细胞中Skp2蛋白水平,验证敲减Skp2基因的效果。通过细胞计数分析,比较K562细胞在Skp2稳定敲减和未敲减情况下的细胞增殖率,对稳定表达sh RNA-ctrl、sh RNA-skp2-1或sh RNA-skp2-2的K562细胞用Ed U染色及Hoechst 33342染色法观察细胞核,检测Ed U阳性细胞与Hoechst 33342阳性细胞的比值。在K562细胞中转染Flag-Skp2质粒,对过表达Skp2的K562细胞行Western Blot分析,采用细胞计数分析法测定过表达Skp2的K562细胞的细胞数变化,并用Ed U染色及Hoechst33342染色观察细胞形态,检测Ed U阳性细胞与Hoechst 33342阳性细胞之比。3.利用Jas PAR软件对编码Skp2基因的上游基因组序列进行分析,在Skp2启动子中发现一个潜在保守的CREB结合区（BR）。染色质免疫沉淀（Ch IP）分析证实CREB基因和Skp2启动子中CREB结合区（BR）的基因片段之间存在特异性结合。构建一系列含野生型CREB-BR（WT）PGL3荧光素酶报告质粒和缺失CREB-BR的突变型（MUT）PGL3荧光素酶报告质粒。将K562细胞与含有野生型或突变型Skp2启动子区的PGL3荧光素酶报告质粒以及Flag或Flag-CREB质粒共转染K562细胞,转染后取细胞溶解物,使用荧光素酶测定其转录活性,用Western Blot法验证CREB的过表达效果,同时通过q RT-PCR测定Skp2的m RNA水平。K562细胞与含有sh RNA-CREB基因或sh RNA-ctrl基因共转染,转染后行Western Blot法证实基因敲减效果,荧光素酶分析转录活性。用q RT-PCR测定CREB基因敲减前后K562细胞中Skp2 m RNA水平变化。4.用伊马替尼（1μmol/L）处理稳定表达sh RNA-ctrl、sh RNA-Akt、sh RNA-CREB或sh RNA-Skp2的K562细胞24 h,采用MTT比色法测定各组细胞活力,分别与sh RNA-ctrl组比较,通过三次实验得出相对细胞活力。用二甲基亚砜或磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂Ly294002（10μmol/L）预处理K562细胞4 h,伊马替尼（1μmol/L）处理24 h,采用MTT比色法测定各组细胞活力,分别与对照组比较,通过三次实验得出相对细胞活力。用伊马替尼（1μmol/L）处理稳定表达sh RNA-ctrl、sh RNA-Akt、sh RNA-CREB或sh RNA-Skp2的K562细胞24 h,Western Blot分析caspase-3/7活性和PARP的裂解。K562细胞分别加用和不加Ly294002预处理再加用伊马替尼（1μmol/L）处理24 h,试剂盒检测caspase-3/7活性并用Western Blot分析PARP的裂解。研究结果:1.和健康对照组相比,Skp2在CML患者中异常表达。收集24例CML患者和7例健康体检者外周血白细胞,CML样本显示Skp2的m RNA水平及蛋白水平均较健康对照组显着上调。数据表明CML患者Skp2表达上调,Skp2蛋白水平与m RNA水平呈一致性改变。2.Skp2是K562细胞增殖的关键。在K562细胞中稳定敲减Skp2基因,与对照组细胞相比,敲减了Skp2的K562细胞的细胞数量显着减少。Ed U分析显示敲减Skp2的K562细胞增殖能力显着低于对照组细胞。3.Skp2过表达影响K562细胞的增殖。与敲减基因结果相反,通过过表达Skp2基因,K562细胞数量增加。与此相关,Skp2过表达导致K562细胞中Ed U阳性细胞百分比显着增加。4.Skp2通过CREB转录调控。利用Jas PAR软件对Skp2编码基因上游基因组序列进行分析,在Skp2启动子中发现一个潜在的CREB结合区（BR）。染色质免疫沉淀（Ch IP）分析显示,CREB能和Skp2基因中CREB结合区（BR）的基因片段特异性。构建一系列包含野生型CREB-BR（WT）PGL3荧光素酶报告质粒和缺失CREB-BR的突变型（MUT）PGL3荧光素酶报告质粒,将含有WT或MUT的Skp2启动子区以及Flag或Flag-CREB的质粒共转染K562细胞,野生型CREB-BR（WT）转录活性在过表达CREB后明显升高,但突变型质粒（MUT）和p GL3空载体转录活性未见明显升高。相反,野生型CREB-BR（WT）转录活性在稳定敲减CREB基因的K562细胞中降低,同样突变型构建体（MUT）和PGL3空载体均未显示转录活性的改变。5.CREB的稳定敲减导致K562细胞中Skp2 m RNA水平显着降低。鉴于CREB的转录活性是由其第133位丝氨酸磷酸化后被活化的,我们试图评估野生型的Flag-CREB和第133位丝氨酸被突变的Flag-CREB-Ser-133A对Skp2表达的影响。野生型的Flag-CREB能够上调Skp2的m RNA水平,但第133位丝氨酸被突变的Flag-CREB-Ser-133A对于Skp2的m RNA水平无明显的调控作用。以上结果提示,在K562细胞中Skp2的表达在转录水平受到CREB的调控。6.抑制PI3K/Akt-CREB-Skp2轴增加K562细胞对伊马替尼的敏感性。用伊马替尼处理（1μmol/L）CREB或Skp2稳定敲减的K562细胞并观察其存活率,CREB或Skp2稳定敲减的K562细胞在伊马替尼处理后表现出细胞活力的急剧下降。7.CREB或Skp2的敲减导致伊马替尼处理的K562细胞中caspase-3/7活性的显着增加。caspase-3/7的活化是对伊马替尼治疗敏感性的响应,CREB或Skp2稳定敲减的K562细胞在伊马替尼处理后与对照组细胞药物处理后相比,caspase-3/7的活化及PARP的裂解更明显。8.PI3K/Akt信号通路在关联CREB的激活及Skp2的表达中起到特定的作用。在K562细胞中稳定敲减Akt或使用LY294002来抑制PI3K/Akt通路,结果导致伊马替尼处理的K562细胞活力显着下降,Skp2蛋白水平降低,caspase-3/7活化及PARP裂解明显增强,说明K562细胞对伊马替尼更加敏感。结论:与健康对照者相比,初治CML患者外周血白细胞中Skp2高表达,并且Skp2高表达对CML细胞增殖至关重要。从机制上讲,在K562细胞中Skp2受PI3K/Akt-CREB信号通路的转录调控。此外,稳定敲减Skp2的表达或阻断PI3K/Akt-CREB通路可显着提高K562细胞对伊马替尼的敏感性。
程志坚[2]（2019）在《第一部分 胶质瘤中SKP2的表达和临床意义 第二部分 术前淋巴细胞和单核细胞比值在胶质母细胞瘤中的诊断意义》文中研究说明第一部分胶质瘤中SKP2的表达和临床意义目的:探究SKP2（S期激酶相关蛋白2）在胶质瘤中表达情况及与临床病理参数间的相关性。方法:本研究通过免疫组化的方式检测395例胶质瘤中SKP2、p-Rb及EGFR表达情况,并分析SKP2与胶质瘤级别、病理类型和预后等临床病理参数间的关系。生存曲线采用Kaplan-Meier法绘制,Long-Rank检验用于比较不同组别间的预后差异。结果:SKP2阳性信号主要位于胶质瘤细胞核中,在匹配的非瘤脑组织中未见明显阳性信号。分析发现SKP2表达与胶质瘤级别相关且主要集中在高级别的胶质母细胞瘤中（P<0.001）。进一步分析发现SKP2的表达与细胞周期蛋白p-Rb和EGFR表达正相关,且与胶质瘤级别无关。然而SKP2和TERT启动子突变则不具有统计学相关性。预后分析结果显示,胶质母细胞瘤中SKP2高表达患者生存时间明显短于SKP2低表达患者（10.04 VS 16.5月,P=0.0029）;并且SKP2低表达的患者对放化疗更加敏感（P=0.124和P=0.122）。Cox回归分析进一步证实SKP2是胶质母细胞瘤独立预后因子。纳入SKP2、IDH1R132H和TERT启动子对GBM患者的预后进行进一步分级,分析发现具有SKP2低表达、IDH1R132H突变和TERT启动子野生型的GBM患者生存时间明显延长。结论:SKP2在胶质母细胞瘤中高表达,并且与临床病理参数密切相关。联合SKP2、IDH1R132H和TERT启动子可对GBM进行更进一步的分型。因此,SKP2可作为判断胶质母细胞瘤患者预后的潜在标志物。第二部分术前淋巴细胞和单核细胞比在胶质母细胞瘤中的诊断意义目的:术前淋巴细胞和单核细胞的比值已被证明能广泛用于判断恶性肿瘤病人的预后。然而,术前LMR在胶质瘤中的情况仍然不清楚。因此本研究旨在探究LMR在胶质母细胞瘤（GBM）中的临床意义。方法:回顾性分析102例胶质母细胞瘤病人临床信息。患者术前常规采集外周血样本,根据医院检验室的检测结果计算淋巴细胞/单核细胞比（LMR）、中性粒细胞/淋巴细胞比（NLR）、血小板/淋巴细胞比（PLR）、纤维蛋白原/白蛋白比（FAR）以及预后营养指数（PNI）。通过免疫组化的方式检测GBM组织Ki67、GFAP和Olig2的表达水平。系统性分析LMR和血液学及病理学标志物的关系。结果:用X-tile软件确定GBM患者术前LMR的Cut-off值为3.2。预后分析结果显示低LMR患者的术后生存时间明显短于高LMR患者（中位总生存期:10.33月VS 18.53月,P=0.0013）,并且低LMR患者1年和2年生存率均低于高LMR患者。单因素和多因素分析进一步明确术前LMR是GBM独立预后因子。进一步分析LMR和其他血液学标志物间的关系,发现LMR与NLR及PLR呈负相关（P<0.001和P=0.001）;与PNI呈正相关（P<0.001）。更重要的是,术前LMR水平和肿瘤组织Ki67表达呈负相关（P=0.0028）,而与GFAP（P=0.0864）及Olig2（P=0.4718）无相关性。结论:术前LMR能预测胶质母细胞瘤预后,低LMR患者预后较差。LMR与NLR、PLR、PNI及肿瘤Ki67表达均存在相关性。因此,LMR是胶质母细胞瘤患者预后的潜在标志物。
孙雅静[3]（2018）在《Skp2在恶性肿瘤的发生及治疗中的研究进展》文中进行了进一步梳理肿瘤发生的根本原因是细胞周期调控紊乱,细胞S期激酶相关蛋白2（S-phase associated kinase protein 2,Skp2）是新近认识的细胞周期调控的蛋白之一。在多种肿瘤中高表达,例如:直肠癌,肺癌,胶质瘤,前列腺癌等;并影响患者预后。Skp2作为肿瘤基因治疗的新的靶点,抑制其表达能有效的控制肿瘤的发展,提高患者的预后,现就Skp2的结构、功能和与肿瘤的相关性进行综述。
王栋[4]（2018）在《MicroRNA-936通过靶向CKS1诱导胶质瘤细胞周期停滞并抑制其增殖的机制研究》文中提出背景:胶质母细胞瘤是成人中常见且预后极差的原发性恶性脑肿瘤。尽管在标准治疗方面取得了进展——手术切除后的放疗和化疗,但患者的预后仍不理想。因此,开发治疗胶质瘤的新的分子靶点和治疗这种疾病的策略就有了现实依据。越来越多的证据表明microRNA在肿瘤的发生发展中发挥重要作用,关于microRNA在胶质瘤中的作用也已经有了一定的研究。这些研究显示microRNA参与细胞的多种功能调节,这些功能包括细胞增殖、细胞凋亡、干细胞分化和神经发育。在之前的研究中报道miR-936的水平在人脑胶质瘤标本中下调。这里,我们进一步研究miR-936在胶质瘤中的潜在作用。方法:1.应用定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术检测miR-936在人脑胶质瘤标本中的表达。2.通过生物信息学分析筛选并推断miR-936的直接靶点,并通过免疫印迹和荧光素酶报告基因测定来进一步验证靶点的正确性。3.通过细胞计数试剂盒8（CCK-8）分析,集落形成实验,5-乙炔基-2-脱氧尿苷（EDU）和流式细胞计量术分析等方法来研究miR-936对神经胶质瘤细胞增殖和胶质瘤细胞细胞周期的影响。4.利用异种移植模型研究miR-936对肿瘤生长的影响。结果:1.人脑胶质瘤标本中miR-936的表达水平明显下调,CKS1被证实为miR-936的靶点。2.胶质瘤细胞周期通过负性调控CKS1及其下游Akt/ERK1/2信号通路。此外,CKS1过表达逆转了miR-936的抑制作用。3.体内研究显示,miR-936水平的升高抑制了肿瘤的生长。结论:通过靶向CKS1,miR-936可以起到抑制胶质瘤生长的作用。
马衍刚[5]（2017）在《RNF126在脑胶质瘤细胞增殖中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景:中枢神经系统肿瘤中最常见的是胶质瘤（Glioma）,约占颅内肿瘤的44.69%,居颅内肿瘤发病率的第一位。现阶段,肿瘤的治疗取得了巨大进步,然而胶质瘤治疗方面所取得的成绩难以令人满意,据统计其五年生存率仅约为5%。总体上看对于该类肿瘤的治疗尚缺乏特效方法,肿瘤病理生理学研究证实胶质瘤细胞因其过度增殖、对临近组织的恶性侵袭及多发性化疗药物耐药等病理机制是该病预后不良的主要因素,其中,过度增殖因素在胶质瘤复发过程中发挥作用最大。在脑胶质瘤的治疗方面虽然采取了放疗、化疗、手术等手段,但治疗效果仍不理想,因此近年来关于胶质瘤的分子治疗研究成为胶质瘤治疗领域中的热点。然而,对于胶质瘤发病因素及发病机理的认识目前仍然较为薄弱,因此探明胶质瘤的发病机制对于提出有效的分子靶向治疗具有重要的意义。在真核核细胞内主要启动两条途径来诱导蛋白的降解:其一,溶酶体途径,内化膜蛋白及被吞入胞内的外来蛋白的降解主要经此途径;其二,非溶酶体途径,此途径主要指导将一些被泛素结合修饰后的胞内蛋白进行降解。泛素为76个氨基酸所构建的蛋白,典型的蛋白泛素化过程需要先后经过泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3的作用进行顺序催化反应,研究发现E3决定了催化底物的特异性。在直接能源物质ATP参与下,泛素-蛋白酶体经泛素的修饰和引导,先后通过E1、E2、E3多步骤复杂的酶促反应,最终使底物蛋白质的特异性氨基酸残基被泛素所标记,从而完成了目标底物蛋白的泛素化。研究表明,大量的蛋白转录后的修饰过程均是通过泛素来进行的。泛素发挥作用机制主要是经三步酶促反应后使其与靶向蛋白上的特定氨基酸残基以共价键相联接。具体来讲,泛素激活酶E1使泛素活化,之后传递给泛素结合酶E2,最后通过泛素连接酶E3的连接作用实现泛素同底物蛋白的赖氨酸残基结合,从而实现了底物蛋白的整体泛素化过程。其中,E2决定泛素修饰反应类型,而E3具有底物特异性。基因工程科学的进展使泛素化精细机制进一步展现,被确定的E1酶有2种,E2酶50余种而E3酶的种类已经多达600余种。E3酶系家族成员可被分为 RING-finger 家族及 HECT（homologous to E6AP C terminus）家族,RING-finger家族的成员最多,其分子结构中所含的E2结合结构域均极其相似,也均发挥将活化泛素转移、连接至靶蛋白氨基酸残基的桥梁作用,该家族E3自身不直接同泛素起作用。HECT家族成员E3具有HECT催化结构域,这使的该类E3不仅直接同E2相结合,更会通过其分子结构中保守Cys残基同活化后的泛素经硫酯键相联接,整体上看,E2将泛素活化后传递给E3,最后由E3将之呈递给底物蛋白,使底物蛋白实现泛素化。随着基因科学、分子生物学技术的飞速发展,越来越多的泛素连接酶被不断发现,泛素化机制及其重要的生物学作用愈加引起相关学者的高度重视。泛素水解蛋白系统是调节蛋白质降解的一个重要途径,由于降解异常导致癌蛋白的积累往往会促进肿瘤的发生和发展。因此,泛素连接酶被人们认为是分子靶向治疗的一个重要靶点。截至目前,已经有多个针对泛素连接酶抑制剂被报道具有较好的抗肿瘤作用,如 Mdm2（Mouse double minute 2）和 NEDD8-Activating Enzyme（NAE）的抑制剂等。RNF126是环指泛素连接酶家族的一员,在其N末端包含一个锌指结构域,在C末端包含一个环指结构域。已有研究表明RNF126可能与肿瘤的发生密切相关,比如乳腺癌。我们的预实验结果显示RNF126在胶质瘤组织和正常脑组织表达存在较大差异,提示RNF126可能是调控胶质瘤发生的一个潜在蛋白。因此,RNF126在胶质瘤中的生物学作用和机制值得进一步研究。第一部分RNF126与p27在胶质瘤中的蛋白表达以及相关性研究目的观察RNF126与p27于人正常脑组织及不同恶性级别的脑胶质瘤组织中表达情况,探究此两种基因之间的表达相关性。方法该部分的研究分成正常脑组织组、Ⅲ级脑胶质瘤组和ⅣV级脑胶质瘤组共三个研究组,其中,正常脑组织标本均取自严重颅脑损伤后接受颅内减压手术患者的正常脑组织。采用Western Blot法检测人脑胶质瘤及正常脑组织内RNF126与p27的蛋白水平,其中胶质瘤和正常脑组织各7例,并进行统计学分析;并分析两种基因表达的相关性。另外,应用Western Blot方法检测了 RNF26在不同恶性程度的胶质瘤细胞中的表达情况。结果1.我们通过免疫印迹法分析了 RNF26和p27在非瘤脑组织及脑胶质瘤组织中的表达情况,结果发现:非瘤脑组织及脑胶质瘤组织中均有RNF126蛋白的表达,而与非瘤脑组织相比,脑胶质瘤中RNF126蛋白表达明显增加,差异有统计学意义（P<0.01）。而p27的表达则与RNF26呈现一定的负相关关系,相关系数r=-0.71。2.我们分析了 RNF126在不同恶性程度的胶质瘤细胞系中的表达情况,结果显示RNF26在不同恶性程度的胶质瘤细胞中存在差异,恶性程度越高,RNF26的表达越高。结论1、RNF126和p27在非瘤脑组织及脑胶质瘤组织中均有表达。RNF126在脑胶质瘤中表达较非瘤组织中表达明显增加,且与细胞周期负调控因子p27呈现负相关性。2、RNF26在恶性程度越高的胶质瘤细胞系表达越高。第二部分RNF126对脑胶质瘤细胞增殖的作用及其分子机制研究目的观察RNF126对胶质瘤细胞增殖能力的影响,探索其中存在的分子作用机制,为胶质瘤分子靶向治疗寻找潜在新作用靶点。方法 1.分子克隆技术构建LV-shRNF126和LV-GFP-RNF126质粒,并包装慢病毒侵染胶质瘤细胞,构建稳定沉默和过表达RNF126的细胞系。2.在构建的稳定细胞系中,进行EdU渗入实验、集落形成实验和MTT实验检测沉默和过表达RNF126的脑胶质瘤细胞增殖能力。3.运用免疫共沉淀技术和免疫印迹实验检测RNF126和p27的相互作用,以及p27的蛋白水平和泛素化水平的变化。结果（1）通过免疫印迹实验检测RNF126沉默效率,免疫印迹实验显示转染pLV-shRNF126#1组细胞中RNF126沉默效果达80%以上。随后应用LV-shRNF126和LV-GFP-RNF126质粒包装慢病毒侵染胶质瘤细胞U251,免疫荧光观察示侵染效率在90%以上且沉默效果良好,提示U251-shRNF126沉默细胞系构建成功。（2）为了验证RNF126对脑胶质瘤细胞增殖的重要性,我们用U251-shRNF 126及U251-control细胞系进行了 EdU实验,EdU实验结果显示:U251-shRNF126增殖率较U251-control增殖率低57%。同时,利用U251-shRNF126及U251-control细胞系进行细胞集落形成实验,其统计结果显示:U251-shRNF126细胞较U251-control克隆形成能力明显降低。另外,我们用U251-shRNF126及U251-control细胞系进行了MTT实验,MTT实验结果同EdU及集落形成实验研究结果一致,显示沉默RNF126后细胞增殖能力明显减弱。以上结果表明沉默RNF126后细胞增殖能力减弱,那么过表达RNF126后脑胶质瘤细胞增殖能力有何变化?为了进一步探讨RNF126对细胞增殖的影响,我们包装了GFP-RNF126和GFP慢病毒,并用慢病毒侵染U251细胞,构建U251-GFP-RNF126和U251-GFP细胞系。免疫荧光实验显示侵染效率在90%以上。为了检测U251-GFP-RNF126细胞系中外源性RNF126表达情况,我们提取U251-GFP-RNF126和U251-GFP细胞蛋白,通过Western Blot实验检测示RNF126在U251细胞中能稳定表达,说明U251-GFP-RNF126和U251-GFP细胞系构建成功。为了进一步验证RNF126促进胶质瘤细胞增殖的作用,我们通过对U251-GFP-RNF126及U251-GFP细胞系中进行EdU实验。EdU检测结果显示U251-GFP-RNF126细胞增殖率较U251-GFP细胞增高110%。通过对U251-GFP-RNF126及U251-GFP细胞系检测细胞集落形成能力,其统计结果显示:U251-GFP-RNF126细胞较U251-GFP细胞克隆形成能力明显提高。MTT实验也显示U251-GFP-RNF126及U251-GFP较对照组增殖能力明显增强。以上实验结果表明RNF126可能在人脑胶质瘤细胞增殖中起着重要作用,沉默RNF126明显抑制胶质瘤细胞增殖,过表达RNF126则明显促进胶质瘤细胞增殖。（3）为进一步探讨RNF126究竟是通过何种分子机制来促进胶质瘤细胞增殖,我们首先在U251细胞中转染FLAG-RNF126后,通过免疫共沉淀技术验证了p27与RNF126的相互作用。实验结果显示在U251细胞中过表达RNF126可以与p27相互结合。进一步内源蛋白Co-IP证明细胞内源的RNF26同样可以与p27相互作用。（4）然后我们又发现,沉默RNF126明显上调p27的蛋白水平,而过表达RNF26则明显下调p27的蛋白水平。相应地,沉默RNF126明显减弱p27的泛素化,而过表达RNF26则明显增加p27的泛素化。最后我们证明RNF126介导的p27降解可以被蛋白酶体抑制剂MG132阻断。我们也试图做了体外泛素化实验,然而我们没有检测到p27的体外泛素化反应。这说明可能有其他一些因素参与到RNF126介导的p27泛素化过程中,比如p27的修饰,或者其他一些接头蛋白等。总之,我们的研究阐明了 RNF26在胶质瘤增殖中高表达,并且可以通过负调控细胞周期抑制子p27促进胶质瘤细胞的增殖。结论（1）在胶质瘤细胞中沉默RNF126细胞增殖能力明显减弱,而过表达RNF126细胞增殖能力明显增强。（2）RNF126可通过增强细胞周期负调控因子p27的泛素化和降解而促进脑胶质瘤细胞增殖。
张红波[6]（2017）在《MiR-9-FOXP2信号在白藜芦醇抑制胶质瘤生长中的作用及机制研究》文中指出第一部分miR-9—FOXP2信号在人脑胶质母细胞瘤中表达及临床预后分析目的:检测FOXP2、miR-9在神经胶质细胞瘤组织中表达,探讨miR-9-FOXP2表达和患者临床特点、术后生存时间之间的关系。方法:选取武汉大学人民医院神经外科2015年1月至2016年12月期间共计70例胶质瘤患者病理标本,采用免疫组织化学技术及qPCR方法检测FOXP2、miR-9在胶质瘤内的表达。依据GBM中FOXP2表达水平高低排序,前20例为低表达组,后20例为高表达组,分析比较GBM与FOXP2和miR-9表达水平之间的关系。总结胶质瘤患者临床资料和随访结果,采用Kaplan—Meier方法分析FOXP2和miR-9表达水平的生存时间和预后。结果:（1）FOXP2在不同级别胶质瘤组织中均表达,高级别（WHOⅢ、Ⅳ级）胶质瘤组织中FOXP2表达阳性率大于90%。表达部位主要在细胞核,其次是细胞质。（2）FOXP2在胶质瘤不同病理类型中表达有差异,随着胶质瘤等级升高,表达升高,P<0.05。（3）FOXP2表达与胶质瘤患者性别、年龄、KPS评分及临床有无症状无明显统计学差异,P>0.05,可以使miR-9和FOXP2改变,而转染miR-9。（4）FOXP2在GBM中表达与临床预后呈负相关,高表达者生存时间短于低表达者,有统计学差异,P<0.05。（5）miR-9在胶质瘤标本中表达,表达水平高低与预后呈正相关,与FOXP2表达水平呈负相关,P<0.05。结论:（1）FOXP2蛋白在不同级别胶质瘤均有表达。（2）FOXP2蛋白表达量高低与胶质瘤病理级别和恶性程度呈正相关。（3）FOXP2蛋白水平的高低与胶质瘤预后密切有关,影响患者生活质量及预后。（4）miR-9在GBM中表达,与FOXP2表达量呈负相关。第二部分RES调控胶质瘤细胞中miR-9—FOXP2信号作用及机理目的:研究白藜芦醇对胶质母细胞瘤细胞的作用,并探索miR-9-FOXP2信号在其中的作用。方法:运用生物信息学软件Pictar、miRBase、Targetscan预测miR-9可能调控的功能靶基因,筛选miR-9调节的转录因子及蛋白。CCK8、EdU、细胞周期实验检测细胞活性和增殖,Annexin V-FITC和流式细胞术检测细胞凋亡检测白藜芦醇作用胶质瘤细胞转染miR-9 mimic和miR-9 inhibitor后转染效率,Western blot和qPCR检测U251细胞株中miR-9及FOXP2表达及作用。双荧光素酶报告鉴定miR-9直接调控靶基因FOXP2,逆转实验验证miR-9-FOXP2在白芦藜醇抑制胶质母细胞瘤中的作用。结果:（1）miRNA数据库成功筛选出FOXP2为hsa-miR-9靶基因。（2）RES抑制胶质母细胞瘤细胞U251增殖,增殖细胞数比例、细胞活性明显低于对照组,P<0.05。细胞周期阻滞于G1期,ras蛋白和cyclinD1蛋白表达降低。（3）RES促进胶质母细胞瘤细胞U251凋亡,细胞凋亡率增加,cleaved-caspase3、Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低,P<0.05。（4）RES调控miR-9及FOXP2蛋白表达,RES处理组FOXP2蛋白表达明显低于对照组,P<0.05,RES处理组miR-9表达高于对照组,P<0.05。（5）miR-9在胶质母细胞瘤U251细胞中调控FOXP2及下游蛋白表达,miR-9高表达后,FOXP2 表达降低,ras、cyclinD1 表达降低,cleaved-caspase3、Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低,P<0.05。（6）miR-9直接调控FOXP2蛋白表达,双荧光素酶报告基因表达分析,hsa-miR-9-5pmimics对FOXP2野生型和突变型载体的报告荧光有较明显的下调作用。（7）miR-9逆转实验显示RES对FOXP2的调控作用消失。（8）EGFR在胶质母细胞瘤细胞U251中的表达,RES处理组EGFR表达较对照组降低,P<0.05。结论:（1）成功筛选出FOXP2是目的miR-9的靶基因。（2）RES使胶质母细胞瘤细胞U251发生G1期阻滞,进而抑制细胞增殖。通过促进bax蛋白表达,bcl-2降低,cleaved-caspase3蛋白活性增加,促进胶质母细胞瘤细胞U251凋亡。（3）RES使胶质母细胞瘤细胞U251细胞中mir-9表达升高,FOXP2表达降低;mir9 对 FOXP2 及下游 cleaved-caspase3,bcl-2 bax,ras,cyclindl 蛋白有相同调控作用。（4）FOXP2是mir9的靶基因,RES通过调控mir-9-foxp2信号抑制胶质母细胞瘤生长。miR-9在胶质母细胞瘤细胞U251中调控FOXP2及下游蛋白表达。（5）发现了白藜芦醇新的作用靶点及FOXP2蛋白功能,促进肿瘤抑制,诱导凋亡。miR-9能够下调FOXP、EGFR基因mRNA及蛋白质的表达,hsa-miR-9-5p可能可调控带有FOXP2基因该段3’UTR的基因的表达。第三部分RES体内调节miR-9-FOXP2信号抑制胶质瘤生长目的:观察白藜芦醇作用裸鼠中肿瘤生长影响和作用,分析裸鼠组织中FOXP2蛋白表达,探讨miR-9-FOXP2信号在白藜芦醇体内抗肿瘤的作用。方法:BALB/C裸鼠皮下移植U251胶质瘤细胞建立裸鼠模型,白藜芦醇50mmol/L每隔三天灌胃,动态记录肿瘤体积和重量变化,观察移植鼠的肿瘤生长情况。裸鼠皮下荷瘤标本固定,石蜡包埋,HE染色,qPCR和Western blot法检测miR-9和FOXP2蛋白表达表达水平变化,肿瘤组织病理学改变。结果:（1）成功建立瘤鼠皮下裸鼠成瘤生长情况,5天后肿瘤体积约6mm3,成瘤率100%。（2）白藜芦醇对裸鼠种植瘤生长抑制作用,RES组肿瘤生长速度及体积较DMSO组减慢,第21天及第24天移植瘤体积大小相比两组差异有统计学意义,第21 天 P=0.0231,第 24 天 P=0.009,。（3）RES抑制胶质瘤生长,RES组裸鼠出现明显皮肤破溃及肿瘤出血坏死明显少于DMSO组。（4）FOXP2在RES和DMSO裸鼠组中的表达,RES作用裸鼠后,WB检测FOXP2蛋白,两组间FOXP2相对表达量有差异,有统计学意义,P<0.001。（5）裸鼠肿瘤组织中miR-9与FOXP2相关性分析显示两者呈负相关,RES组mir-9表达量高于对照组,差异具有统计学意义,P=0.0038,P<0.01。结论（1）一定剂量的白藜芦醇能在裸鼠体内发挥抗瘤作用,白藜芦醇抑制肿瘤生长。（2）白藜芦醇能在裸鼠体内发挥抗瘤作用,随用药时间延长出现抗瘤效应。（3）白藜芦醇能降低胶质瘤细胞内FOXP2表达。（4）白藜芦醇通过miR-9—FOXP2信号发挥抗瘤作用。
郭续艳[7]（2016）在《Cks1对胶质瘤细胞增殖、侵袭及迁移的影响》文中指出目的:周期素依赖性蛋白激酶亚单位1 （Cks1-Cyclin-dependent protein kinase subunit 1）,是一种高度保守的调控细胞周期进程的关键性的调节蛋白,对细胞周期的调控起到重要的作用。国内外研究发现Cks1可引起多种肿瘤的发生及病变并在多种肿瘤中都有不同程度的异常表达,本研究旨在探讨Cks1在胶质瘤细胞中的表达及其对胶质瘤细胞生物学功能的影响。方法:本研究首先运用免疫组织化学染色（IHC）、免疫荧光实验（IF）及QRT-PCR实验,检测了 Cks1在正常脑组织、胶质瘤组织及正常星形胶质细胞（HA）、胶质瘤细胞（U87MG）中的表达;然后我们以胶质瘤细胞系U87MG为研究对象,对其进行Cks1siRNA慢病毒感染,应用QRT-PCR、Western Blot实验技术检测感染siCks1后Cks1的抑制效果;为了解其对胶质瘤细胞系细胞增殖能力的影响设计进行CCK-8、集落形成（平板克隆）实验,运用Transwell技术及细胞划痕实验探索胶质瘤细胞在抑制Cks1表达之后侵袭、迁移能力的改变,最后,应用Western Blot实验技术检测MEK、ERK及p-ERK等因子的变化。结果:免疫组织化学、免疫荧光及QRT-PCR实验结果显示Cks1在胶质瘤细胞中有表达,表达定位于细胞核内,并且U87胶质瘤细胞中Cks1的表达量较HA正常星形胶质细胞中Cks1的表达量低。慢病毒感染后,QRT-PCR、Western Blot实验技术检测感染siCks1后Cks1的抑制效果,结果显示抑制组siCks1 1#、siCks13#抑制效果较siCks1 2#抑制效率高,统计分析差异有统计学意义（P< 0.05）;CCK8、集落形成（平板克隆）实验结果显示,抑制Cks1表达后,与空白对照组相比胶质瘤细胞增殖能力增强,而Transwell技术及细胞划痕实验结果显示,抑制Cks1表达后,与空白对照组相比胶质瘤细胞侵袭及迁移能力均增强,统计分析差异有统计学意义（P< 0.05）; Western Blot结果显示MEK、ERK表达未减少但p-ERK表达量增多,统计分析差异有统计学意义（P<0.05）。本课题为寻找治疗胶质瘤的作用靶点提供了新的思路和理论依据。结论:1、Cks1在胶质瘤细胞中有表达,并定位于细胞核,并且胶质瘤细胞中Cks1的表达量较正常星形胶质细胞中Cks1的表达量低。2、抑制Cks1的表达,胶质瘤细胞的增殖、侵袭及迁移能力增强。3、抑制Cks1的表达,胶质瘤细胞中ERK磷酸化水平升高,Cks1可能通过p-ERK的变化促进胶质瘤细胞的增殖进而影响胶质瘤的发生。
沈晓燕,房晓,蒋磊,盛平,丁茂华,仇冠中,吴小军,胡国汉[8]（2014）在《Cks1、Skp2和p27在人脑胶质瘤中的表达及相互关系》文中研究说明目的研究周期素依赖性蛋白激酶亚单位1（Cks1）、S期激酶相关蛋白2（Skp2）和周期素依赖性蛋白激酶抑制物p27在人脑胶质瘤中的表达及相互关系,同时探讨Cks1对胶质瘤恶性生物学进展的可能作用机制。方法收集上海长征医院神经外科自2009年6月至2011年6月手术切除的胶质瘤组织标本34例及颅脑外伤内减压术中切除的非肿瘤脑组织10例,运用免疫组化EnVision法检测Cks1、Skp2和p27的蛋白表达水平并比较相互关系。结果正常脑组织、低级别（WHOⅠ、Ⅱ级）和高级别（WHOⅢ、Ⅳ级）胶质瘤中Cks1蛋白表达的免疫反应评分（IRS）分别为4.90±2.38,3.20±2.98和2.16±2.52,随胶质瘤病理级别进展表达下降,三者差异有统计学意义（P<0.05）。Skp2在正常脑组织中无表达,低级别和高级别胶质瘤中的IRS为1.00±1.13和2.26±2.23,随胶质瘤病理级别进展表达增加,差异有统计学意义（P<0.05）。正常脑组织中p27表达IRS为7.80±0.63,低级别和高级别胶质瘤中IRS分别为5.00±2.10和2.21±1.47,差异有统计学意义（P<0.05）。34例胶质瘤组织标本中,Cks1表达与p27表达呈正相关（r=0.380,P=0.027）,Skp2表达水平与Cks1、p27均无相关性（r=0.080,P=0.662;r=-0.160,P=0.376）。结论 Cks1、Skp2和p27可作为评价胶质瘤良恶性程度的参考指标;Cks1可能通过促进p27蛋白聚集起到抑制脑胶质瘤恶性进展作用。
余惠平[9]（2014）在《干扰Notch2对神经胶质瘤抑制的研究》文中研究指明胶质瘤是最常见的中枢神经系统的恶性肿瘤,具有较强的侵袭性和进展性。目前临床治疗上采用的主要方法有手术切除、放疗及化疗的综合疗法,但由于胶质瘤的生长特性,与周围脑组织界限不清,手术难以切除完全,而放疗、化疗由于胶质瘤对其耐受性等治疗的局限性,疗效有限,患者中位生存期较短,尤其对于高级别胶质瘤,治疗后复发率较高,预后差,中位生存期不足一年,病死率高,严重威胁患者生命影响人类健康。研究其发病机制,寻找新的有效的治疗方法是临床研究的主要目标之一。细胞周期调控和细胞凋亡与肿瘤的发生与发展过程密切相关,在胶质瘤发生和发展过程中,存在着很多信号传导系统,复杂而精细调控机体内环境的平衡,癌基因及抑癌基因对细胞周期及细胞凋亡通路调节的失控,信号通路传导系统异常刺激肿瘤细胞增殖与进展,发生细胞癌变。在分子水平上的免疫治疗和基因治疗是近年来胶质瘤治疗研究的新方向,通过抑制异常激活的信号传导通路,调控细胞周期,是促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖的有效措施之一Notch信号通路是在无脊椎动物和脊椎动物中普遍存在的,在进化上具有高度的保守性的信号传导通路,在细胞增殖、分化、发育中具有重要的关键性作用。Notch信号通路与恶性肿瘤的关系已成为近年来的研究热点之一,其与肿瘤通路有较多的相互作用,Notch受体和配体在多种肿瘤中表现为异常表达,与多种肿瘤的发生、发展关系密切。且在不同类型的肿瘤中,甚至在同一肿瘤的不同发展阶段,Notch表达的作用也不尽相同,可表现为致癌性,也可表现为抑癌性。Notch受体包括Notchl-4种,研究显示,每种受体在肿瘤中的生物学功能有所不同,甚至截然相反,因此,有必要对每种Notch受体分别进行研究。关于Notch信号与肿瘤生成的因果关系尚无定论,在肿瘤细胞中发现Notch信号通路异常,寻找到可能的靶点,通过体外试验和动物实验等方法,靶向研究Notch信号通路异常对肿瘤生成的影响,探讨Notch信号通路和肿瘤生成的作用机制,以期对肿瘤诊断和治疗提供新的思路和方法,是研究的常用模式。RNA干扰技术是研究基因功能的有效手段,有利于迅速的发现药物作用的有效靶点,并通过体外细胞培养等实验技术来得以证实。短发夹状RNA （shRNA）是设计为能够形成发夹结构的非编码小分子RNA,可被细胞核内自身基因表达序列表达,可以通过内源性的RNA干扰来抑制特定基因的表达,可使靶向基因长时间稳定沉默。质粒载体是shRNA主要载体之一,能使目的shRNA穿过生理屏障,并在细胞核内完成自我复制发挥稳定持久的干扰效果。以质粒构建shRNA并转染细胞是肿瘤分子水平研究的重要手段之一。裸鼠是先天性胸腺缺陷的突变小鼠,是肿瘤学研究中常用的动物模型,其免疫缺失和便于观察等特点,使其在肿瘤研究中被广泛应用。近年来研究发现Notch信号在人类脑胶质瘤中也发挥作用,但Notch信号在胶质瘤的发生和发展中的具体作用尚不明确。本实验应用免疫组化方法对32例脑胶质瘤标本和20例脑组织标本进行Notch2蛋白的检测,研究Notch2在人类脑胶质瘤中的表达及意义。并构建Notch2-shRNA干扰质粒对人胶质瘤细胞株U251进行转染,建立稳定转染的细胞株,利用实时定量PCR、蛋白印迹法（western blot）, MTT法及流式细胞术（FCM）等检测各组细胞周期、细胞增殖和细胞凋亡情况。再以Notch2基因敲除的U251细胞株建立裸鼠皮下移植瘤模型,观察Notch2对体内肿瘤的生成和肿瘤生长的影响,为临床肿瘤治疗提供可靠的论依据。本实验共分为3个部分。第一部分Notch2蛋白在人脑胶质瘤组织中的表达及意义目的：研究Notch2蛋白在人脑胶质瘤组织中的表达及临床意义。方法：选择胶质瘤标本22例和正常脑组织标本20例为研究对象,采用免疫组化法检测并比较其Notch2表达,并分析Notch2表达与胶质瘤病理分级的相关性。结果：Notch2表达在胶质瘤组织中显着高于正常脑组织中Notch2表达（P<0.001）。在Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤中Notch2的表达显着低于Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤中Notch2的表达（P<0.01）。结论：Notch2与胶质瘤发生、发展密切相关,为胶质瘤的诊断和治疗提供新的思路和理论依据。第二部分Notch2-shRNA稳定转染对人脑胶质瘤细胞株U251增殖、凋亡和细胞周期的影响目的：研究Notch2-shRNA稳定转染对人脑胶质瘤细胞株U251增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法：构建Notch2-shRNA干扰质粒及相同载体的无意义序列Negative-shRNA对人胶质瘤细胞株U251进行转染,建立稳定转染的细胞株,分别作为Notch2-shRNA干扰组和Negative-shRNA干扰组,并以未转染U251细胞作为未转染对照组,利用实时定量PCR、蛋白印迹法（western blot）测定各组Notch2及相关蛋白的表达情况,采用MTT法观察各组U251细胞生长情况,采用流式细胞术（FCM）检测各组细胞周期和细胞凋亡情况。结果：与Negative-shRNA干扰组和未转染组相比,Notch2-shRNA干扰组细胞中Notch2蛋白及其活性片段NICD蛋白在Notch2-shRNA干扰组中表达显着降低,cyclinD1和MCM2蛋白在Notch2-shRNA干扰组中的表达亦明显降低,p21和p27蛋白的表达明显升高。MTT生长曲线显示,Notch2-shRNA干扰组细胞生长速度较Negative-shRNA干扰组和未转染组更慢,尤其从第5天开始,Notch2-shRNA干扰组生长速度较其他两组显着降低（均P=0.000<0.001）。Notch2-shRNA干扰组、Negative-shRNA组和未转染组的U251细胞的凋亡率分别为（13.22±1.90）%、（2.62±0.26）%和（2.47±0.36）%,Notch2-shRNA干扰组显着高于Negative-shRNA组和未转染组,差异均有统计学意义（P=0.003,P=0.003）。在G1期,Notch2-shRNA干扰组细胞百分比显着高于Negative-shRNA干扰组和未转染组（P=0.000<0.001,P=0.000<0.001,）,在S期,Notch2-shRNA干扰组细胞百分比显着低于Negative-shRNA干扰组和未转染组（P=0.000<0.001,P=0.000<0.001,）。结论：Notch2与胶质瘤U251细胞增殖、凋亡及细胞周期有关,抑制Notch2表达可抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,使细胞周期在G1/S期被阻滞,其作用的发挥可能是通过下调cyclinD1和MCM2蛋白的表达和上调p21和p27蛋白的表达实现的。第三部分Notch2-shRNA稳定转染细胞株U251的裸鼠皮下移植研究目的：研究Notch2蛋白抑制的人胶质瘤细胞株U251的致瘤性及对裸鼠生存时间的影响。方法：以Notch2-shRNA及相同载体无意义序列Negative-shRNA稳定转染的U251细胞株、和未转染的U251细胞株建立裸鼠皮下移植瘤模型,每组各10只,定期测量肿瘤大小,绘制肿瘤生长曲线；移植后60天每组随机取4只裸鼠处死,称量瘤重并计算肿瘤抑制率,免疫组化法检测肿瘤中Notch2表达水平；对各组其余裸鼠记录并比较其生存时间。结果：Notch2-shRNA转染组裸鼠肿瘤生长较Negative-shRNA转染组和未转染组更缓慢,肿瘤体积更小,至各组裸鼠接种第60d, Notch2-shRNA转染组、Negative-shRNA转染组和未转染组的肿瘤大小分别为（2.72±0.21）mm2、（9.23±0.17）mm2和（9.91±0.77）mm2, Notch2-shRNA转染组裸鼠肿瘤体积显着小于Negative-shRNA转染组和未转染组,差异均有统计学意义（P=0.000<0.001,P=0.000<0.001）。细胞接种60d后Notch2-shRNA转染组、Negative-shRNA转染组和未转染组平均瘤重分别为（0.46±0.04）g、（1.32±0.03）g和（1.35±0.11）g,Notch2-shRNA转染组瘤重显着小于Negative-shRNA转染组和未转染组,差异均有统计学意义（P=0.000<0.001,P=0.000<0.001）。Notch2-shRNA转染组抑瘤率为65.74%; Notch2-shRNA转染组Notch2表达明显小于Negative-shRNA转染组和未转染组（P<0.01）。 Notch2-shRNA转染组、Negative-shRNA转染组和未转染组裸鼠生存时间分别为（114.33±9.05）d、（70.83±10.50）d和（71.67±8.82）d, Notch2-shRNA转染组裸鼠的生存时间显着长于Negative-shRNA转染组和未转染组（P<0.001）。结论：抑制Notch2表达可显着降低U251细胞的致瘤性,抑制胶质瘤生成和进展,为胶质瘤的基因治疗提供理论依据。
沈晓燕[10]（2013）在《周期素依赖性蛋白激酶亚单位1（Cks1）在人脑胶质瘤中的表达及意义》文中研究指明研究目的人脑胶质瘤是中枢神经系统发病率最高的恶性肿瘤，目前的治疗方案主要以传统的外科手术切除联合放疗和化疗；由于肿瘤的高度增殖及恶性侵袭，胶质瘤无法彻底治愈。新兴的胶质瘤治疗手段之一的基因治疗，通过研究与胶质瘤生物学行为密切联系的特征性基因及特异性蛋白，运用靶向方法，来达到抑制肿瘤生长甚至消除瘤体的目的，但该治疗方法还远未成熟。有关胶质瘤的研究重点之一，就是寻找合适的能调控其恶性行为的靶向性分子标志物，并进一步揭示其作用机理。本研究通过检测周期素依赖性蛋白激酶亚单位1（cyclin kinase subunit1，Cks1）在人脑胶质瘤及正常脑组织中的表达差异，并结合患者临床病理学特征及随访资料进行统计学数据处理，初步探讨Cks1表达与胶质瘤病理级别、生存预后的关系；进一步通过过表达Cks1慢病毒载体构建，检测Cks1过表达对胶质瘤细胞系的细胞周期的影响，从而探讨Cks1在胶质瘤生物学进程中的功能及作用，或为临床胶质瘤治疗提供新的分子靶向性标志物。研究方法运用免疫组织化学EnVision法及蛋白印迹实验检测Cks1，Skp2，p27在脑胶质瘤组织切片及正常脑组织切片中的蛋白表达水平，对样本患者进行临床病例资料的随访，结合患者病理学特征运用统计学软件进行相关统计学分析。运用PCR等技术构建Cks1过表达慢病毒载体LV5（EF1-GFP/Puro），蛋白印迹实验检测Cks1的表达量并通过流式细胞学技术分析Cks1过表达后胶质瘤细胞系A172细胞周期的影响，初步探讨Cks1在脑胶质瘤发生发展过程中的作用。结果免疫组织化学EnVision法显示Cks1蛋白主要表达在肿瘤细胞细胞核。在正常脑组织中几乎全部有表达，其阳性染色的细胞百分率为58.54±15.66%，在低级别胶质瘤（WHOⅠⅡ级）和高级别胶质瘤（WHOⅢⅣ级）中的阳性细胞百分率分别为31.25±27.50%和19.62±18.75%，随着病理级别增高而有降低趋势，三者比较有统计学差异（p<0.05）。Skp2、p27蛋白主要表达在肿瘤细胞细胞核。在正常脑组织中Skp2全部无表达，低级别胶质瘤（WHOⅠⅡ级）和高级别胶质瘤（WHOⅢⅣ级）中阳性细胞百分率分别为6.97±5.50%和17.51±17.68%，随病理级别增高而增多，统计学分析表明三者差异有统计学意义（p<0.05）。在正常脑组织中p27表达强阳性，正常脑组织、低级别胶质瘤（WHOⅠⅡ级）和高级别胶质瘤（WHOⅢⅣ级）中阳性细胞百分率分别为85.50±7.17%、51.11±19.87%和23.78±17.53%，随病理级别增高而降低，差异有统计学意义（p<0.05）。Western blot显示Cks1在正常脑组织，低级别胶质瘤和高级别胶质瘤中的蛋白印迹实验条带光密度相对值分别为6.43±1.03、3.61±1.45、1.21±0.87，三者比较差异有统计学意义（p<0.05）。在三个蛋白两两比较中，统计分析提示仅Cks1与p27表达之间呈正相关（r=0.38，p<0.05），Cks1和Skp2表达之间无相关性（r=0.08，p>0.05），p27和Skp2之间无相关性（r=-0.16，p>0.05）。在评价胶质瘤预后的影响因素时，Cox回归单因素分析提示低肿瘤级别、全切除率、低Skp2和高p27表达对生存预后有利（p<0.05），Cks1表达水平对胶质瘤患者生存时间无统计学意义（p>0.05）。进一步在高级别胶质瘤亚组中对临床有意义指标年龄、切除率、Cks1和Skp2表达水平运用Cox比例风险模型多因素分析，结果提示年龄<55岁、全切除及Cks1高表达的胶质瘤患者有更好的预后（p<0.05）。通过PCR等技术成功构建过表达Cks1慢病毒载体LV5（EF1-GFP/Puro），转染胶质瘤细胞系A172后蛋白印迹实验提示Cks1表达量较母细胞系增高（5.77±0.92vs2.46±0.12，p<0.05）。经流式细胞学技术分析提示过表达Cks1后肿瘤细胞时相变化主要集中在G2/M期，与无目的基因Cks1的干扰组细胞系比较，有统计学意义（38.13±0.72vs15.23±0.33，p<0.05）。结论Cks1在胶质瘤组织中表达于肿瘤细胞核，其表达量随肿瘤级别增高而降低。胶质瘤中，Cks1表达水平与p27表达呈正相关，Cks1高表达对于高级别胶质瘤是延长生存时间的保护因素。Cks1抑制肿瘤发展可能是通过阻滞G2/M期检验点从而影响细胞周期进展，未来仍需要进一步研究Cks1在胶质瘤中的确切功能。
二、Skp2和p27在人脑胶质瘤中的表达及其意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Skp2和p27在人脑胶质瘤中的表达及其意义（论文提纲范文）
（1）Skp2对慢性髓细胞白血病细胞增殖及其对伊马替尼敏感调控机制的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 Skp-2 在恶性肿瘤发生机制中的作用 |
| 参考文献 |
（2）第一部分 胶质瘤中SKP2的表达和临床意义 第二部分 术前淋巴细胞和单核细胞比值在胶质母细胞瘤中的诊断意义（论文提纲范文）
| 中英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文第一部分 胶质瘤中 SKP2 的表达和临床意义 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 论文第二部分 术前淋巴细胞和单核细胞比在胶质母细胞瘤中的诊断意义 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（4）MicroRNA-936通过靶向CKS1诱导胶质瘤细胞周期停滞并抑制其增殖的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 1.MiR-936在神经胶质瘤组织和细胞系中下调 |
| 2.miR-936抑制神经胶质瘤细胞的增殖 |
| 3.CKS1是miR-936 在神经胶质瘤细胞中的靶基因 |
| 4.在神经胶质瘤细胞中CKS1 下调和miR-936 过表达具有相似的作用 |
| 5.CKS1 再导入减弱了miR-936 的抑制作用 |
| 6.miR-936抑制裸鼠皮下种植肿瘤的生长并降低肿瘤中的CKS1蛋白水平 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（5）RNF126在脑胶质瘤细胞增殖中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略语表 |
| 第一部分 RNF126与p27在胶质瘤中的蛋白表达以及相关性研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 RNF126对脑胶质瘤细胞增殖的作用及其分子机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 文献综述 泛素化过程及其在肿瘤中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文文章1 |
| 英文文章2 |
（6）MiR-9-FOXP2信号在白藜芦醇抑制胶质瘤生长中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 主要缩略词简表 |
| 引言 |
| 第一部分 miR-9-FOXP2信号在人脑胶质母细胞瘤中表达及临床预后分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 白藜芦醇调控胶质瘤细胞中miR-9-FOXP2信号作用及机理 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 白藜芦醇体内调节miR-9-FOXP2信号抑制胶质瘤生长的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 攻读博士学位期间申请科研课题 |
| 攻读博士学位期间参加学术会议论文及发言 |
| 攻读博士学位期间获得奖励 |
| 攻读博士学位期间参编书籍 |
| 致谢 |
（7）Cks1对胶质瘤细胞增殖、侵袭及迁移的影响（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 周期素依赖性蛋白激酶亚单位1的相关研究 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的成果 |
| 致谢 |
（9）干扰Notch2对神经胶质瘤抑制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 Notch2蛋白在人脑胶质瘤组织中的表达及意义 |
| 1 研究背景 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 Notch 2-shRNA稳定转染对人脑胶质瘤细胞株U251增殖、凋亡和细胞周期的影响 |
| 1 研究背景 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 Notch 2 shRNA稳定转染细胞株U251的裸鼠皮下移植研究 |
| 1 研究背景 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 全文讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 中英文名词缩写与对照 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
| 统计学审稿证明 |
（10）周期素依赖性蛋白激酶亚单位1（Cks1）在人脑胶质瘤中的表达及意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 实验第一部分：Cks1 在人脑胶质瘤中表达及与临床病理学特征、生存预后的关系 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 实验第二部分：过表达 Cks1 对胶质瘤细胞系细胞周期的影响 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在校期间主要科研活动和成果 |
| 致谢 |
四、Skp2和p27在人脑胶质瘤中的表达及其意义（论文参考文献）
- [1]Skp2对慢性髓细胞白血病细胞增殖及其对伊马替尼敏感调控机制的研究[D]. 陈晓文. 安徽医科大学, 2021(01)
- [2]第一部分 胶质瘤中SKP2的表达和临床意义 第二部分 术前淋巴细胞和单核细胞比值在胶质母细胞瘤中的诊断意义[D]. 程志坚. 安徽医科大学, 2019(08)
- [3]Skp2在恶性肿瘤的发生及治疗中的研究进展[J]. 孙雅静. 国际免疫学杂志, 2018(05)
- [4]MicroRNA-936通过靶向CKS1诱导胶质瘤细胞周期停滞并抑制其增殖的机制研究[D]. 王栋. 南京医科大学, 2018(01)
- [5]RNF126在脑胶质瘤细胞增殖中的作用及机制研究[D]. 马衍刚. 山东大学, 2017(03)
- [6]MiR-9-FOXP2信号在白藜芦醇抑制胶质瘤生长中的作用及机制研究[D]. 张红波. 武汉大学, 2017(06)
- [7]Cks1对胶质瘤细胞增殖、侵袭及迁移的影响[D]. 郭续艳. 滨州医学院, 2016(04)
- [8]Cks1、Skp2和p27在人脑胶质瘤中的表达及相互关系[J]. 沈晓燕,房晓,蒋磊,盛平,丁茂华,仇冠中,吴小军,胡国汉. 中华神经医学杂志, 2014(04)
- [9]干扰Notch2对神经胶质瘤抑制的研究[D]. 余惠平. 南方医科大学, 2014(01)
- [10]周期素依赖性蛋白激酶亚单位1（Cks1）在人脑胶质瘤中的表达及意义[D]. 沈晓燕. 第二军医大学, 2013(05)